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Síntesis de oligonucleótidos

Enero 18, 2022

La síntesis de oligonucleótidos es la síntesis química de fragmentos relativamente cortos de ácido nucleico con una secuencia estructural química definida. La técnica es extremadamente útil en la práctica actual en laboratorios, porque provee un acceso rápido y barato a oligonucleótidos hechos a la medida con una secuencia deseada. Mientras que las enzimas sintetizan ADN y ARN en una dirección de 5' a 3', la síntesis de oligonucleótidos se lleva a cabo en el sentido opuesto, en la dirección 3' a 5'. Actualmente, el proceso está implementado como una síntesis en fase sólida usando el método de la fosforoamidita y bloques de construcción de fosforoamidita derivados de 2'-deoxinucleósidos (dA, dC, dG y T), ribonucleósidos (A, C, G y U), o nucleósidos químicamente modificados, como los ANB.

Para obtener el oligonucleótido deseado, se acoplan secuencialmente los bloques de construcción a la cadena de oligonucleótidos en el orden requerido por la secuencia del producto (ver Ciclo de Síntesis más abajo). El proceso ha sido automatizado completamente desde finales de la década de 1970. Al completarse el ensamblado de la cadena, se libera el producto de la fase sólida a la solución, luego se le desprotege, y finalmente se le recolecta. La existencia de reacciones secundarias establece límites prácticos a la longitud de los oligonucleótidos sintéticos (hasta aproximadamente 200 residuos de nucleótido) debido a que el número de errores se acumulan con la longitud del oligonucleótido sintetizado.[1]​ Los productos suelen ser aislados mediante HPLC para obtener los oligonucleótidos deseados en una alta pureza. Típicamente, los oligonucleótidos sintéticos son moléculas de DNA o RNA de una sola hebra de aproximadamente 15–25 bases de longitud.

Los oligonucleótidos tienen muchas aplicaciones tanto en el campo de biología molecular como en medicina. Son comúnmente utilizados como oligonucleótidos de antisentido, SiRNA, partidores para secuenciación de ADN y amplificación, sonda genética para detectar ADN o ARN complementario vía hibridación molecular, herramientas para la introducción dirigida de mutaciones y sitios de restricción, y para la síntesis artificial de genes.

Historia

La evolución de la síntesis de oligonucleótidos ha visto cuatro métodos principales de formación de los enlaces internucleosídicos y ha sido revisada en la literatura con gran detalle.[2]​[3]​[4]​

Primeros trabajos y síntesis contemporánea de H-fosfonato

A principios de la década de 1950, el grupo de Alexander Robert Todd fue pionero en los métodos de H-fosfonato y triéster de fosfato para la síntesis de oligonucleótidos.[5]​[6]​ La reacción de los compuestos 1 y 2 para formar el diéster de H-fosfonato 3 es una reacción de copulación en solución, mientras que la de los compuestos 4 y 5 para dar 6 es una copulación fosfotriéster (ver síntesis fosfotriéster más abajo).

Treinta años más tarde, este trabajo inspiró, independientemente, a dos grupos de investigación para adoptar la química del H-fosfonato a la síntesis de fase sólida, usando monoésteres H-fosfonato de nucleósidos 7 como bloques de construcción, y cloruro de pivaloílo, cloruro de 2,4,6-triisopropilsulfonilo (TPS-Cl), y otros compuestos como activadores.[7]​[8]​ La implementación práctica del método del H-fosfonato resultó en un ciclo sintético muy corto y simple, consistiendo de solo dos etapas, detritilación y copulación (Esquema 2). La oxidación de los enlaces diéster H-fosfonato internucleosídicos en 8 a enlaces fosfodiéster en 9 (X = O) con una solución de yodo en piridina acuosa es llevada a cabo al final del ensamblado de la cadena, como un paso en el ciclo sintético. Alternativamente, 8 puede ser convertido en el fosforotioato 10 [9]​[10]​[11]​[12]​ o en fosforoenolato 11 (X= Se),[13]​ o oxidado por CCl4 en presencia de aminas primarias o secundarias a análogos de fosforamidato 12.[14]​[15]​ El método es muy conveniente en varios tipos de modificaciones de fosfato(fosfato/fosforotioato/fosforamidato) y puede ser introducido al mismo oligonucleótido para la modulación de sus propiedades.[16]​[17]​[18]​

Muy a menudo, la construcción de bloques de H-fosfonato está protegida en el grupo 5'-hidroxi y en el grupo amino de las bases nitrogenadas Adenina, Citosina y Guanina de la misma manera que los bloques de construcción de la fosforamidita (ver abajo). Sin embargo, la protección del grupo amino no es obligatoria.[19]​[20]​

 
Esquema 1. i: N-Chlorosuccinimida; Bn = -CH2Ph
 
Esquema 2. Síntesis de oligonucleótidos por el método de H-fosfanato

Síntesis de fosfodiéster

 
Esquema 3. Unión de oligonucleoótidos por el método de fosfodiester; Tr = -CPh3

En la década de 1950, Har Gobind Khorana y sus colaboradores desarrollaron un método de fosfodiéster donde el 3’-O-acetilnucleósido-5’-O-fosfato 2(Esquema 3) se activaba con N,N’-diciclohexilcarbodiimida (DCC) o cloruro de 4-toluensulfonilo (Ts-Cl) y un nucleósido 5’-O protegido 1 se hizo reaccionar con la especie activada para dar un monofosfato de dinucleósido protegido 3.[21]​ Tras la eliminación del grupo acetilo 3’-O usando hidrólisis alcalina, se llevó a cabo una posterior elongación de la cadena. Siguiendo esta metodología, se sintetizaron conjuntos de tri- y tetradeoxirribonucleótidos, los que fueron convertidos enzimáticamente en oligonucleótidos más largos, lo que permitió la elucidación del código genético. La principal limitación del método del fosfodiéster consistía en la formación de oligómeros de pirofosfato y oligonucleótidos ramificados en el fosfato internucleosídico. El método parece ser un paso atrás desde la química más selectiva descrita anteriormente; sin embargo, en aquel entonces, no habían sido introducidos la mayor parte de grupos protectores de fosfato que hay hoy en día. La falta de una estrategia de protección conveniente necesitaba tomar una retirada a una química más lenta y menos selectiva para lograr el objetivo último del estudio.[2]​

Síntesis de fosfotriéster

En la década de 1960, grupos dirigidos por R. Letsinger[22]​ y C. Reese[23]​ desarrollaron una solución basada en fosfotriéster. La diferencia que define de la solución basada en fosfodiéster era la protección de la entidad fosfato en el bloque constructor 1 (Esquema 4) y en el producto 3 con el grupo 2-cianoetilo. Esto precluía la formación de oligonucleótidos ramificados en el fosfato internucleosídico. La mayor selectividad del método permitió el uso de agentes copulantes y catalizadores más eficientes,[24]​[25]​ lo que redujo dramáticamente la duración de la síntesis. El método, inicialmente desarrollado para la síntesis en fase de solución, fue también implementado en poliestireno,[26]​ lo que inició un esfuerzo de investigación masivo en síntesis en fase sólida de oligonucleótidos y condujo eventualmente a la automatización del ensamblaje en las cadenas de oligonucleótidos.

 
Esquema 4. Unión de oligonucleótidos por el método de fosfotriéster; MMT = -CPh2(4-MeOC6H4).

Síntesis de triéster fosfito

En la década de 1970, sustancialmente más reactivos P(III) derivados de nucleósidos, 3'-O-clorofosfito, fueron usadas de manera exitosa en la formación de enlaces internucleosídicoss.[27]​ . Esto llevó al descubrimiento de la metodología del triéster fosfito. El grupo liderado por M. Caruthers tuvo la ventaja de tener 1H-tetrasolidofosfitos menos agresivos y más selectivos y por lo tanto implementaron el método en una fase sólida.[28]​ Poco tiempo después, los trabajadores del mismo grupo mejoraron el método usando nucleósidos fosforamiditos más estables como bloques de construcción.[29]​ El usar 2-cianoetil como grupo protector del fosfito.[30]​ en lugar de un grupo metilo.[31]​[32]​ más difícil de usar llevó a los nucleósidos fosforamiditos que se usan actualmente en la síntesis de oligonucleótidos (ver los bloques de construcción de fosforamiditos). Después vinieron muchas mejoras en la fabricación de los bloques de construcción, en los sintetizadores de oligonucleótidos y en los protocolos de sintetización que hicieron que la química de fosforamiditos fuera un método muy seguro y fácil para la preparación de oligonucleótidos sintéticos.[33]​

Síntesis por medio del método de fosforamiditos

Bloques de construcción

Fosforamiditos de nucleósidos

 
Fosforamiditos 2'-desoxinucleósidos protegidos

Como fue mencionado previamente, los nucleótidos de origen natural (nucleósido-3' o fosfatos 5') y sus análogos de fosfodiéster no son lo suficientemente reactivos para poder llevar a cabo la aceleración de la preparación sintética de oligonucleótidos en altos rendimientos.

La selectividad y el tipo de formación de los enlaces internucleosídicos aumenta drásticamente al usar 3'-O-(N,N-diisopropil fosforamidita) derivados de nucleósidos (fosforamiditos de nucleósidos) que tienen una función de bloques de construcción en el método de triéster fosfito. Para prevenir una reacción secundaria no deseada, todos los demás grupos funcionales presentes en los nucleósidos tienen que ser no reactivos (protegidos) uniendo grupos protectores. Después de que el ensamblado de la cadena de oligonucleótidos ha sido completada, todos los grupos protectores son removidos para dar lugar a los oligonucleótidos deseados. A continuación se muestran los grupos protectores usados actualmente que se encuentran disponibles comercialmente[34]​[35]​[36]​[37]​ y los fosforamiditos de nucleósidos más comunes en los bloques de construcción:

  • El grupo 5'-hidroxilo está protegido por un grupo ácido-lábil DMT (4,4'-dimetoxitritil).
  • Timina y uracilo, bases nitrogenadas de timidina y uridina, respectivamente, no tienen grupos amino exocíclicos y por lo tanto no requieren ninguna protección.
  • La guanosina y la 2'-deoxiguanosina tienen un grupo amino exocíclico, su basicidad es baja al grado en el que no reacciona con fosforamiditos bajo las condiciones de una reacción de copulación. Sin embargo, un fosforamidito derivado de N2-no protegido 5'-O-DMT-2'-desoxiguanosina es poco soluble en acetonitrilo, el solvente que es comúnmente usado en la síntesis de oligonucleótidos.[38]​ En contraste, las versiones de N2-protegidas del mismo compuesto son solubles en acetonitrilo y por lo tanto son muy usadas. Las bases nitrogenadas adenina y citosina tienen grupos amino exocíclicos reactivos con los fosforamiditos activados bajo las condiciones de una reacción de copulación. Bajo el uso de pasos adicionales en el ciclo de sintetización[39]​[40]​ o agentes alternativos de copulación y sistemas de solvatación,[38]​ el ensamblaje de la cadena de oligonucleótidos se puede llevar a cabo usando dA y dC fosforamiditos con grupos amino no protegidos. Sin embargo, estos intentos se encuentran actualmente en el campo de investigación. La síntesis de oligonucleótidos, los grupos amino exocíclicos en los nucleósidos son protegidos permanentemente en todo el proceso de ensamblaje de la cadena de oligonucleótidos.

La protección de los grupos amino exocíclicos tiene que ser ortogonal al grupo 5'-hidroxilo porque el último es removido al final de cada ciclo sintético. La estrategia más fácil de implementar y por lo tanto la más aceptada es en la que los grupos aminos exocíclicos tienen una protección base-lábil. Lo más común es usar dos esquemas de protección.

  • En la primera, el esquema estándar y más robusto (Figura), protección de Bz (benzonil) es usada para A, dA y dC, mientras que G y dG son protegidas por un grupo isobutritil. Recientemente, el grupo Ac (acetilo) ha sido usado para proteger C y dC como se muestra en la figura.[41]​
  • En la segunda, en el esquema leve de protección, A y dA son protegidos con grupos de isobutritil[42]​ o fenoxiacetil (PAC).[43]​ C y dC tienen protección de acetil,[41]​ y G y dG son protegidos con grupos de 4-isopropilfenoxiacetil (Pr-PAC)[44]​ o dimetilformamidino (dmf).[45]​ Los grupos de protección leve son removidos más fácilmente que los grupos de protección estándar. Sin embargo, los fosforamiditos que contienen estos grupos son menos solubles cuando están almacenados en solución.
  • El grupos fosfito es protegido por un grupo de base-lábil 2-cianoétil.[32]​ Una vez que un fosforamidito ha sido unido al soporte sólido de oligonucleótidos y los restos del fosfato se han convertido en especies P(V), la presencia de la protección del fosfato no es necesaria para que las reacciones de copulación se lleven a cabo de manera exitosa.[46]​
  • En la síntesis de RNA, el grupo 2'-hidroxilo es protegido por el grupoTBDMS (t-butildimetilsilil)[47]​[48]​[49]​[50]​ o con el grupo TOM (tri-iso-propilsililoximetil),[51]​[52]​ los dos pueden ser removidos con un tratamiento del ion floruro.
  • Los restos del fosfito también tienen al diisopropil amino (Pr2N) reactivo bajo condiciones ácidas. Cuando se activa, el grupo diisopropilamino se va para ser sustituido por el grupo 5'-hidroxilo que está unido al soporte del oligonucleótido (ver "paso 2: unión" en la parte de abajo)
 
2'-O-ARN fosforamiditos de nucleósidos protegidos

Nucleósidos no fosforamiditos

 
Fosforamiditos no nucleósidos para la modificación 5' de los oligonucleótidos sintéticos. MMT = mono-metoxitritil, (4-metoxifenil) difenilmetil

Los nucleósidos no fosforamiditos son los reactivos de fosforamiditos que están diseñados para introducir diversas funciones en los extremos de los oligonucleótidos sintéticos o entre los residuos de los nucleótidos a la mitad de una secuencia. Para poder ser introducidos en una secuencia, un modificador no nucleosídico tiene que tener por lo menos 2 grupos hidroxilos, uno de ellos suele estar protegido por el grupo DMT, mientras que el otro contiene los restos del fosforamidito reactivo.

Los fosforamitos no nucleosídicos son usados para introducir los grupos deseados que no están disponibles en los nucleósidos naturales o que pueden ser introducidos de manera más fácil usando diseños químicos más simples. En el esquema para la demostración de la diversidad estructural y funcional disponible se puede ver una pequeña selección de reactivos de fosformaidito comercial. Estos reactivos sirven para la unión del fosfato 5'-terminal (1),[53]​ NH2 (2),[54]​ SH (3),[55]​ aldehído (4),[56]​ y grupos carboxílicos (5),[57]​ CC triples enlaces(6),[58]​ marcadores no radioactivos y desactivadores (ejemplificados por 6-FAM amidita 7[59]​ para la fijación de fluoresceína y DABCYL amidita 8,[60]​ respectivamente), modificadores hidrofílicos e hidrofóbicos (ejemplificados por hexaetilenglicol amidita 9[61]​[62]​ y colesterol amidita 10,[63]​ respectivamente) y amidita biotina 11.[64]​

Ciclo sintético

La síntesis de oligonucleótidos se lleva a cabo por una adición gradual de residuos de nucleótidos al extremo 5' de la cadena creciente hasta que la secuencia deseada sea ensamblada. Cada adición tiene que ver con un ciclo sintético (esquema 5) y consiste en cuatro reacciones químicas:

 
Esquema 5. Ciclo sintético para la preparación de oligonucleótidos por el método de foforamiditos

Paso 1: El desbloqueo (detritilación)

El grupo DMT es removido con la solución de un ácido, puede ser 2% de ácido tricloroacético (TCA) o 3 % de ácido dicloroacético (DCA), en una solución inerte (diclorometano o tolueno). El catión DMT de color naranja es desteñido; el resultado de este paso es un oligonucleótido sólido unido al soporte que contiene una terminal 5'-hidroxilo libre. Es importante recordar que llevar a cabo una detritilación por un largo periodo de tiempo o con soluciones de ácidos más fuertes de las recomendadas puede llevar a una depurinación del soporte sólido ligado al oligonucleótido y por lo tanto reduce el rendimiento del producto deseado.

Paso 2: Unión

Una solución de 0.02-0.2 M de fosforamidito de nucleósido ( o una mezcla de varios fosforamiditos) en acetonitrilo es activado por una solución 0.2-0.7 M de un catalizador azol ácido, 1H-tetrazol, 5-ethylthio-1H-tetrazole,[65]​ 2-benzylthiotetrazole,[66]​[67]​ 4,5-dicyano imidazol,[68]​ o otros compuestos similares. En un análisis reciente, se puede encontrar mayor información en el uso de varios agentes de unión en la síntesis de oligonucleótidos.[69]​ La mezcla suele ser muy corta y ocurre en las líneas de fluido de los sintetizadores de oligonucleótidos (ver abajo) mientras que los componentes son entregados a los reactores que contienen el soporte sólido. La fosforamidita activada en 1.5-20 veces excede el soporte unido al material y es conectado con el soporte de sólido del principio (primera unión) o con un soporte unido al oligonucleótido precursor (siguientes uniones) cuyo grupo 5'-hidroxilo reacciona con los restos del fosforamidito activado del nucleósdio del fosforamidito que entra para formar un enlace fosfito triéster. La unión de los fosforamiditos 2'-desoxinucleosido es muy rápida y requiere, a pequeña escala, aproximadamente 20 s para poder llevarse a cabo. En contraste, 2'-O protegido de fosforamiditos de ribonucleósido requieren de 5 a 15 minutos para poder ser unidos en sistemas más complejos.[48]​[70]​[71]​[72]​ La reacción es muy sensible a la presencia de agua, especialmente cuando se usan soluciones diluidas de fosforamiditos, y normalmente se lleva a cabo por acetonitrilo anhídrido. Generalmente, a gran escala, en la síntesis, el exceso es menor y la concentración de fosforamiditos es mayor. La concentración del activador es determinada por su solubilidad en acetonitrilo, independientemente de la escala de la síntesis. Después de que la unión es completada, todos los reactivos que no fueron unidos y los productos no deseados se remueven mediante un lavado.

Paso 3: taponado

El paso del taponado se lleva a cabo mediante el tratamiento del soporte sólido unido al material con una mezcla de anhídrido acético y con 1-metilimidazol, o, menos común, DMAP como catalizadores en el método de fosforamiditos. Tiene dos propósitos:

  • Después de completar la reacción de unión, un porcentaje pequeño del soporte de sólido unido a grupos 5'-OH (0.1 a 1%) no reacciona y por lo tanto necesita ser bloqueado permanentemente de la elongación de la cadena para prevenir la formación de oligonucleótidos con una deleción de bases internas, que se refiere normalmente como (n-1) cortameros. Los grupos 5'-hidroxilos son acetilados por una mezcla de taponado.
  • También ha sido reportado que los fosforamiditos que se activan con 1H-tetrazol reaccionan con la posición O6 de la guanosina.[73]​ Después de la oxidación con I2/ agua, el producto secundario, posiblemente a través de la migración de O6-N7, pasa a la depurinación. Los sitios apurinicos que se forman, se rompen fácilmente al final de la desprotección del oligonucleótido bajo las condiciones básicas (ver abajo) para dar lugar a oligonucleótidos más cortos y de esta forma reducir el rendimiento del producto completado. Las modificaciones de O6 son removidas rápidamente por un tratamiento con el reactivo de taponado siempre y cuando el paso del taponado se lleve a cabo antes de la oxidación con I2/ agua.
  • La síntesis de fosfotrioatos de oligonucleótidos (OPS, ver abajo) no se involucra con la oxidación con I2/agua, y por lo tanto no sufre los efectos secundarios de la reacción que se describe anteriormente. Por otro lado, si el paso de taponado se lleva a cabo antes de una sulfurización, el soporte sólido puede contener los residuos del anhídrido acético y de N-metilimidazol que quedaron después del paso de taponado. La mezcla de taponado, interfiere con la reacción de transferencia de sulfuro, que resulta en la formación de los enlaces internucleosídicos de fosfato triester en el lugar de los triesteres PS deseados. Por lo tanto, para la síntesis de OPS, es recomendado llevar a cabo el paso de sulfurización antes del paso de taponado.[74]​

Paso 4: oxidación

El enlace fosfito tricoordinado que se acaba de formar no es natural y tiene estabilidad limitada bajo las condiciones de la síntesis de oligonucleótidos. El tratamiento del soporte unido al material con yodo y agua en presencia de una base débil (piridina, lutidina, o colidina) oxida el fosfito triester en un fosfato triester tetracoordinado, que es un precursor protegido de un enlace internucleosídico de fosfato diester que ocurre de manera natural. La oxidación puede llevarse a cabo bajo condiciones anhídridas usando terc-butil hidroperoxido[75]​ o, más eficiente, (1S)-(+)-(10-camphorsulfonyl)-oxaziridino (CSO).[76]​[77]​[78]​ El paso de oxidación es sustituido con un paso de sulfurización para obtener fosfotrioatos de oligonucleótido (ver fosfotrioatos de oligonucleótido y su síntesis en la parte de abajo). En el último caso, el paso de sulfurización es mejor si se da antes del taponado.

Soporte sólido

En la síntesis de la fase sólida, el oligonucleótido es ensamblado mediante enlaces covalentes, a través de su terminal 3' del grupo hidroxilo, a un soporte soólido de material y restos unido a él durante todo el curso de la cadena de ensamblado. El soporte sólido está contenido en columnas cuyas dimensiones dependen en la escala de la síntesis y pueden variar entre 0.05mL y varios litros. La mayoría de los oligonucleótidos son sintetizados en una escala pequeña que va de los 40nmol a 1μmol. Recientemente, la síntesis compleja de los oligonucleótidos en donde el soporte sólido se encuentra en los pozos de las placas de múltiples pozos (comúnmente, 96 o 384 pozos por placa) se ha convertido en una opción para la síntesis paralela de oligonucleótidos en pequeña escala.[79]​ Al final de la cadena de ensamblado, los oligonucleótidos son liberados del soporte sólido y son eluidos de la columna o del pozo.

Material de soporte sólido

En contraste con la síntesis de la fase sólida orgánica y la síntesis peptídica, la síntesis de oligonucleótidos procede mejor en soportes sólidos no hinchables. Los dos materiales más usados en la fase sólida son el vidrio de poro controlado (CPG) y el poliestireno macroporoso(MPPS).[80]​

  • CPG es definido comúnmente por su tamaño de poro. En la química de oligonucleótidos, los tamaños de poros de 500, 1000, 1500, 2000 y 3000 Å se usan para permitir la preparación de 50, 80, 100, 150 y 200 oligonucleótidos, respectivamente. Para hacer que el CPG sea adecuado para el procesamiento, la superficie del material es tratada con (3-aminopropil) trietoxisilano para dar CPG al aminopropil. El brazo del aminopropil puede ser extendido para dar lugar a una cadena larga conocida como aminoalkil (LCAA) CPG. El grupo amino se usa como un punto adecuado de anclaje para los enlazadores en la síntesis de oligonucleoótidos (ver abajo)
  • MPPS es adecuado para la síntesis de oligonucleótidos cuando son poco hinchables, el poliestireno altamente reticulado es obtenido por la polimerización de divinilbenceno (min 60%), estireno y 4-clorometilestireno en la presencia de un agente poroso. Los macroporos de clorometil MPPS obtenidos se convierten en aminometil MPPS.

Química enlazadora

 
Soportes de sólido comerciales para la síntesis de oligonucleótidos

Para que el material del soporte sólido sea adecuado para la síntesis de oligonucleótidos, los enlazadores no nucleosidicos o los succionatos de nucleosido deben de estar unidos por un enlace covalente a un grupo amino reactivo, como aminopropil CPG, LCAA CPG o aminometil MPPS. El resto de los grupos aminos que no reaccionaron son cubiertos con anhídrido acético. Hay tres diferentes grupos de soportes de sólidos que se usan normalmente.

  • Soportes universales. En un método más reciente, más conveniente y más usado, la síntesis empieza con el soporte universal, en donde un enlazador no nucleosídico es ligado al material del soporte del sólido (compuestos 1 y 2). Un fosforamito respectivo al residuo de nucleósido de 3'-terminal es acoplado al soporte sólido universal en el primer ciclo de síntesis en el ensamblaje del oligonucleótido usando los protocolos estándar. Después de esto el ensamblaje de cadena continua hasta que es completado y entonces el sólido de soporte es unido al oligonucleótido es desprotegido. La característica distintiva del sólido de soporte universal es que la liberación de los oligonucleótidos ocurre debido a la escisión hidrolítica de un enlace P-O que conecta el 3'-O de la 3'-terminal del residuo del nucleótido al enlazador universal como se muestra en el esquema 6. La ventaja crítica de este enfoque es que el mismo sólido de soporte es usado sin importar la secuencia de los oligonucleótidos que se desean sintetizar. Para remover por completo el enlazador y el fosfato 3'-terminal del oligonucleótido ensamblado, el sólido de soporte 1 y varios sólidos de soporte similares [81]​ requieren amonio gaseoso,[82]​ hidróxido de amonio acuoso, metilamina acuosa,[83]​ o su mezcla[84]​ y están comercialmente disponibles .[85]​[86]​ El soporte sólido 2[87]​ requiere una solución de amonia en metanol anhídrido y también está comercialmente disponible.[88]​[89]​
  • Soportes sólidos nucleosídicos. En un primer acercamiento, el grupo 3'hidroxilo del residuo del nucleosido 3'-terminal se une al soporte sólido a través de 3'-O-succinil como un compuesto 3. El ensamblaje de la cadena del oligonucleótido empieza con la unión de un bloque de construcción de fosforamidita al segundo residuo de nucleótido de 3'-terminal. El grupo hidroxilo 3'-terminal en oligonucleótidos sintetizados en soportes de sólido nucleosídicos son desprotegidos bajo ciertas condiciones, que son más ligeras que aquellas que aplican para los soportes de sólidos universales. Sin embargo, el hecho de que un soporte de sólido nucleosídico tenga que ser seleccionado en una secuencia específica reduce la complejidad del proceso sintético e incrementa la posibilidad del error humano.
  • Soportes sólidos especiales. Son usados como para la adjunción de los grupos funcionales deseados en la 3'-terminal de los oligonucleótidos sintéticos. Por ejemplo, el soporte de sólido comercial[90]​ el soporte sólido 4[91]​ permite la preparación de oligonucleótidos que contienen en su 3'-terminal, enlazador 3-aminopropil. De manera similar a los fosforamiditos no nucleosídicos, hay otros soportes de sólidos diseñados para la fijación de grupos funcionales reactivos, grupos locutores no reactivos y modificadores terminales (por ejemplo, colesterol o otras ataduras hidrofóbicas) y adecuados a varias aplicaciones que están comercialmente disponibles. Información más detallada en varios soportes de sólidos para la síntesis de oligonucleótidos pueden encontrarse en un repaso reciente.[79]​
 
Esquema 6. Mecanismo de 3'-desfosforilación de oligonucleótidos ensamblados en un soporte de sólido universal

Fosforotioatos de oligonucleótidos y su síntesis

 
Enlaces Sp y Rp diasterómeros internucleosídicos de fosforotioato

Los fosforotioatos de oligonucleótidos (OPS) son oligonucleótidos modificados en donde uno de los átomos de oxígeno en los restos del fosfato es reemplazado por un azufre. Solamente los fosforotioatos que tienen sulfuro en una posición en la que no se juntan, como se muestra en la figura, son muy usados y están disponibles comercialmente. El reemplazo del oxígeno que no une con el sulfuro, crea un nuevo centro quiral en el fósforo. En el caso de un dinucleótido, esto resulta en la formación de un diasterómero de monofosforotioatos Sp y Rp dinucleósidos, cuyas estructuras se muestran en la figura. En un oligonucleótido n-mer donde todos los (n-1) enlaces internucleosídicos son enlaces de fosforotioato, el número de diasterómeros m es calculado com m = 2(n – 1). Como son análogos de ácidos nucleicos no naturales, los OPS son sustancialmente más estables en la hidrolisis de nucleasas, las enzimas que se encargan de destruir ácidos nucleicos al romper los puentes del enlace P-O en la mitad del fosfodiester. Esta propiedad determina el uso de OPS como oligonucleótidos antisentido in vitro y en vivo, aplicaciones donde la amplia exposición a las nucleasas es inevitable. De manera similar, para mejorar la estabilidad de los siRNAs, al menos un enlace de fosforotiato es introducido en la terminal 3' en las hembras de ambos sentidos y de antisentido. En cuanto a la quiralidad, los OPS puros, todos los diasterómeros Sp son más estables a la degradación enzimática que sus análogos Rp.[92]​ Sin embargo la preparación de la quiralidad de los OPS puros sigue siendo un reto sintético.[12]​[93]​ En las prácticas de laboratorio, diferentes mezclas de diasterómeros de OPS son usadas normalmente.

La síntesis de los OPS es muy parecida a la de los oligonucleótidos naturales. La diferencia es que el paso de oxidación es reemplazado por una transferencia de sulfuro (sulfuración) y que el sistema de taponado es llevado a cabo hasta después de la sulfuración. Solo hay 3 reactivos reportados capaces de llevar a cabo la transferencia de sulfuro eficiente y que estén comercialmente disponibles:

 
Agentes de transferencia de azufre comerciales para la síntesis de oligonucleótidos.
  • 3-(Dimethylaminomethylidene)amino)-3H-1,2,4-dithiazole-3-thione, DDTT (3) provee cinética rápida de sulfuración y alta estabilidad en la solución.[74]​[94]​[95]​ El reactivo está disponible de varias fuentes.[96]​[97]​
  • 3H-1,2-benzodithiol-3-one 1,1-dioxide (4)[98]​[99]​ también conocido con el reactivo de Beaucage, tiene una mejor solubilidad en acetonitrilo y tiempos cortos de reacción. Sin embargo el reactivo en solución tiene una estabilidad limitada y es menos eficiente en los enlaces de sulforización de RNA.[94]​[95]​
  • N,N,N'N'-Tetraethylthiuram disulfide (TETD) es soluble en acetonitrilo y es comercialmente disponible.[100]​ Sin embargo, la reacción de sulfurización de un enlace internucleosídico de DNA con TETD requiere 15 minutos,[101]​ lo que es más de 10 veces más lento que en los compuestos 3 y 4.

Automatización

En el pasado, la síntesis de oligonucleótidos se llevaba a cabo manualmente en solución o en fase sólida. La síntesis de la fase sólida fue implementada usando, como contenedores de la fase sólida, columnas de vidrio miniatura similares en la forma de columnas de cromatografía de baja presión o jeringas con filtros porosos.[102]​ Actualmente la síntesis de oligonucleótidos en fase sólida se lleva a cabo de manera automática usando instrumentos controlados por computadora (sintetizadores de oligonucleótidos) y son técnicamente implementados en formatos de columna, placa de pozos múltiples, y de arreglos. El formato de columna funciona mejor en la investigación y en aplicaciones a grande escala, cuando la síntesis no es compleja.[103]​ El formato de la placa de pozos múltiples está diseñado específicamente para la síntesis compleja en una escala pequeña para satisfacer la creciente demanda de la industria y académica para la síntesis de oligonucleótidos.[104]​ Se encuentran disponibles comercialmente un número de sintetizadores de oligonucleótidos para una síntesis a pequeña escala[105]​[106]​[107]​[108]​[109]​ y también para la síntesis de mediana a larga escala[110]​

Síntesis de medio a largo plazo de la síntesis de oligonucleótidos - Historia

Los sintetizadores de oligonucleótidos a larga escala eran desarrollados con frecuencia aumentando las capacidades de una plataforma de instrumentos preexistente. En 1980 surgió uno de los primeros sintetizadores a mediana escala, fue fabricado por la compañía Biosearch, en Novato, CA (8800). Esta plataforma fue originalmente diseñada como un sintetizador de péptidos y su usaba un reactor de lecho de fluido esencial para el alojamiento de las características de hinchamiento de poliestireno en los soportes utilizados en la metodología de Merrifield. La síntesis de oligonucleótidos involucra el uso de CPG (vidrio de poro controlado) que es un soporte rígido más adecuado para los reactores de columna que se describen en la parte de arriba. La escala de 8800 estaba limitada al flujo requerido para fluidizar el soporte. Algunos de los diseños de los reactores de novel, así como que las presiones estuvieran por arriba de lo normal permitían al 8800 alcanzar escalas que podían preparar 1mmol de oligonucleótidos. A mediados de los años 1990, varias compañías desarrollaron plataformas basadas en líquidos de cromatografía preparativas y semi-preparativas. Estos sistemas eran adecuados para un enfoque de reactor de columna. En la mayoría de los casos lo único que se requería era aumentar el número de fluidos que podían ser entregados a una columna. La oligo síntesis requiere un mínimo de 10 y los líquidos de cromatografía normalmente acomodan 4. Esto era una tarea de diseño fácil y algunas estrategias semi automáticas funcionaban sin hacer ninguna modificación al equipo LC que ya existía. PerSeptive Biosystems y Pharmacia (GE) eran 2 de las muchas compañías que desarrollaron sintetizadores a partir de cromatografías líquidas. Genomic Technologies, Inc.[111]​ era una de las pocas compañías que desarrollo sintetizadores de oligonucleótidos a larga escala. La plataforma inicial llamada VLSS que significa sintetizadores a muy grande escala por sus siglas en inglés, utilizaba columnas de cromatografía líquida como reactores y podía sintetizar hasta 75 milimoles de material. Muchas fábricas de síntesis de oligonucleótidos diseñaban y producían sus propias plataformas y por eso se conoce poco de estas. El diseño VLSS continuó perfeccionándose y continúa en el sintetizador Qmaster [112]​ que es una plataforma a pequeña escala que produce cantidades de miligramos a gramos de oligonucleótidos sintetizados. Las prácticas actuales de la síntesis de los oligonucleótidos químicamente modificados a larga escala han sido revisados recientemente.[113]​

Síntesis de los microarreglos de oligonucleótidos

El microarreglo de un oligonucleótido puede ser visto como una placa de pozos múltiples, en donde las paredes que dividen los pozos son removidos intencionalmente. Con respecto a la parte química, la síntesis de los microarreglos de oligonucleótidos es diferente a la síntesis de oligonueclótidos convencional en dos cosas principales:

  • Los oligonucleótidos permanecen unidos a la fase sólida de manera permanente, lo que requiere el uso de enlazadores que sean estables bajo las condiciones del final del procedimiento de desprotección.
  • Es necesario usar técnicas de sitio selectivo de 5'-desprotección al considerar las siguientes razones: la ausencia de divisores físicos entre los sitios ocupados por los oligonucleótidos individuales, un espacio muy limitado en la superficie del microarreglo (una secuencia de oligonucleótido ocupa un cuadrado de 25×25 μm)[114]​ y el requerimiento de alta fidelidad de la síntesis del oligonucleótido. En un enfoque, cuando el grupo 5'-O-ODMT es removido, se ve efectuado por una generación electroquímica del ácido en los sitios requeridos.[115]​ Otro enfoque, usa 5'-O-(a-metil-6-oxicarbonilo piperonilo nitro) (MeNPOC) como grupo protector, el cual puede ser removido con radiación de luz UV a 365 nm de longitud de onda.[114]​
 
5'-O-MeNPOC-nucleósido protegido de fosforamidito

Procesamiento post-sintético

Después de que el ensamblaje de la cadena es completado, el soporte sólido unido al oligonucleótido está totalmente protegido:

  • El grupo 5'-terminal 5'-hidroxilo es protegido por el grupo DMT;
  • Los restos del fosfato internucleosídico o fosforotrioato están protegidos por los grupos 2-cianoétilo.
  • Los grupos amino exocíclicos en todas las bases nitrogenadas, excepto en T y U, están protegidos por grupos protectores acilo.

Para que el oligonucleótido sea funcional, todos los grupos protectores deben ser removidos. La base N-acil de protección y el 2-cianoetil fosfato de protección pueden ser removidos simultáneamente con el tratamiento de bases inorgánicas o de aminas. Sin embargo, la aplicabilidad de este método está limitada por el hecho de que la hendidura del 2-cianoetilo fosfato de protección lleva a la formación de acrilonitrilo como un producto secundario. Bajo las condiciones básicas que se requieren para remover la protección del N-acilo, el acrilonitrilo es capaz de una alquilación de bases nitrogenadas, principalmente, en la posición N3 de los residuos de la timina y el uracilo para dar lugar a los respectivos aductos de N3-(2-cianoetil) a través de la reacción de Michael. La formación de estos productos secundarios puede ser evitada tratando a los oligonucleótidos unidos al soporte sólido con soluciones de bases en un solvente orgánico, por ejemplo, con 50% trietilamina en acetonitrilo[116]​ o con 10% de dietilamina en acetonitrilo.[117]​ Este tratamiento es muy recomendado para las preparaciones de mediana y gran escala y es opcional para la síntesis de pequeña escala, donde la concentración generada de acrilonitrilo en la desprotección es baja.

Independientemente de si los grupos protectores de fosfato son removidos primero, los oligonucleótidos unidos al soporte sólido son desprotegidos usando uno de los dos enfoques generales:

  • (1) A menudo, el grupo 5'-DMT es removido al final del ensamblaje de la cadena de oligonucleoótidos. Los oligonucleótidos son liberados de la fase sólida y desprotegidos (base y fosfato) por tratamiento con hidróxido de amonio acuoso, metilamina acuosa, sus mezclas,[41]​ amonio gaseoso o metilaminane[118]​ o, menos común, soluciones de otras aminas primarias o álcalis a temperatura ambiente o elevada. Esto remueve toda la protección que quedaba en los grupos de 2'-desoxioligonucleótidos, resultando una mezcla que contiene el producto deseado. Si los oligonucleótidos contienen residuos de ribonuleótidos 2'-O-protegidos, el protocolo para la desprotección incluye un segundo paso en el que el 2'-O-protector de grupos sillyl son removidos mediante un tratamiento con ion floruro a través de varios métodos.[119]​ El producto totalmente desprotegido puede ser usado así, o el oligonucleótido puede ser purificado por varios métodos. El más común es cuando el producto crudo es desalinizado usando precipitación de etanol, cromatografía por exclusión de tamaño o HPLC de fase reversa. Para eliminar productos de truncación no requeridos, los oligonucleótidos pueden ser purificados mediante electroforesis en gel de poliacrilamida o de intercambio aniónico HPLC seguido de desalinización.
  • (2) El segundo enfoque solamente es usado cuando el método de purificación es HPLC de fase reversa. En este caso, el grupo 5'-terminal DMT que sirve como manija hidrofóbica para purificación, permanece hasta el final de la síntesis. El oligonucleótido es desprotegido bajo las condiciones básicas descritas anteriormente y a partir de una evaporación, es purificado mediante una HPLC de fase reversa. El material recolectado es posteriormente detritilación bajo condiciones ácidas acuosas. En una pequeña escala (menos de 0.01-0.02mmol), se usa el tratamiento con 80% de ácido acético acuoso durante 15-30 minutos a temperatura ambiente, seguido por una evaporación de la mezcla. Finalmente el producto es desalinizado, como fue descrito anteriormente.
  • Para algunas aplicaciones, grupos informadores adicionales pueden estar unidos a un oligonucleótido usando una variedad de procedimientos post-sintéticos.

Caracterización

 
Deconvulción ES MS de un oligonucleótido crudo 5'-DMT-T20 (masa calculada 6324.26 Da).

Así como con cualquier otro compuesto orgánico, es prudente caracterizar oligonucleótidos sintéticos según su preparación. En casos más complejos (investigación y síntesis a gran escala) los oligonucleótidos se caracterizan por su desprotección y su purificación. A pesar de que el enfoque principal de la caracterización es la secuenciación, una rutina relativamente económica, las consideraciones en la reducción de costos evitan su uso en la rutina de la fabricación de oligonucleótidos. En la práctica del día a día, es suficiente con obtener la masa molecular de un oligonucleótido mediante el registro de su espectro de masa. Hay dos métodos que son usados en la caracterización de oligonucleótidos: electrospray de espectometría de masa (ES MS) y láser asistido por matriz de desorción / espectrometría de masas de ionización de tiempo de vuelo (MALDI-TOF). Para obtener el informe de espectro, es muy importante cambiar todos los iones de metal que puedan estar presentes en la muestra de iones de amonio o de tetraalquilamonio antes de someter una muestra al análisis por cualquiera de los métodos mencionados.

  • En un espectro ES MS, un oligonucleótido en específico genera una serie de iones que corresponden a diferentes estados de ionización del compuesto. En consecuencia, el oligonucleoótido con masa molecular M genera iones con masas (M-nH)/n donde M es la masa molecular del oligonucleótido en forma de un ácido libre (todas las cargas negativas de los grupos fosfodiéster internucleosídicos son neutralizados con H+), n es el estado de ionización y H es la masa atómica del hidrógeno (1 Da). Los iones con un rango n de 2 a 5 son más útiles para la caracterización. Recientemente el software suministrado con los instrumentos fabricados es capaz de llevar a cabo un procedimiento de deconvolución, lo que significa que encuentra picos de iones que pertenecen al mismo conjunto y que deriva la masa molecular del oligonucleótido.
  • Para obtener información más detallada de la impureza del perfil de los oligonucleótidos se usa la cromatografía líquida de masa (LC-MS o HPLC-MS)[120]​ o electroforesis capilar de espectometría de masa(CEMS)[121]​

Véase también

Referencias

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Más lecturas

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  • Beaucage, S. L.; Iyer, R. P. (1993). «The functionalization of oligonucleotides via phosphoramidite derivatives». Tetrahedron 49: 1925-1963. doi:10.1016/s0040-4020(01)86295-5. 
  • Beaucage, S. L.; Iyer, R. P. (1993). «The synthesis of modified oligonucleotides by the phosphoramidite approach and their applications». Tetrahedron 49: 6123-6194. doi:10.1016/s0040-4020(01)87958-8. 
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Enlaces externos

  • Oligonucleotide calculator – Bio-Synthesis

Véase también


  •   Datos: Q2620256

Enero 18, 2022
síntesis, oligonucleótidos, síntesis, oligonucleótidos, síntesis, química, fragmentos, relativamente, cortos, ácido, nucleico, secuencia, estructural, química, definida, técnica, extremadamente, útil, práctica, actual, laboratorios, porque, provee, acceso, ráp. La sintesis de oligonucleotidos es la sintesis quimica de fragmentos relativamente cortos de acido nucleico con una secuencia estructural quimica definida La tecnica es extremadamente util en la practica actual en laboratorios porque provee un acceso rapido y barato a oligonucleotidos hechos a la medida con una secuencia deseada Mientras que las enzimas sintetizan ADN y ARN en una direccion de 5 a 3 la sintesis de oligonucleotidos se lleva a cabo en el sentido opuesto en la direccion 3 a 5 Actualmente el proceso esta implementado como una sintesis en fase solida usando el metodo de la fosforoamidita y bloques de construccion de fosforoamidita derivados de 2 deoxinucleosidos dA dC dG y T ribonucleosidos A C G y U o nucleosidos quimicamente modificados como los ANB Para obtener el oligonucleotido deseado se acoplan secuencialmente los bloques de construccion a la cadena de oligonucleotidos en el orden requerido por la secuencia del producto ver Ciclo de Sintesis mas abajo El proceso ha sido automatizado completamente desde finales de la decada de 1970 Al completarse el ensamblado de la cadena se libera el producto de la fase solida a la solucion luego se le desprotege y finalmente se le recolecta La existencia de reacciones secundarias establece limites practicos a la longitud de los oligonucleotidos sinteticos hasta aproximadamente 200 residuos de nucleotido debido a que el numero de errores se acumulan con la longitud del oligonucleotido sintetizado 1 Los productos suelen ser aislados mediante HPLC para obtener los oligonucleotidos deseados en una alta pureza Tipicamente los oligonucleotidos sinteticos son moleculas de DNA o RNA de una sola hebra de aproximadamente 15 25 bases de longitud Los oligonucleotidos tienen muchas aplicaciones tanto en el campo de biologia molecular como en medicina Son comunmente utilizados como oligonucleotidos de antisentido SiRNA partidores para secuenciacion de ADN y amplificacion sonda genetica para detectar ADN o ARN complementario via hibridacion molecular herramientas para la introduccion dirigida de mutaciones y sitios de restriccion y para la sintesis artificial de genes Indice 1 Historia 1 1 Primeros trabajos y sintesis contemporanea de H fosfonato 1 2 Sintesis de fosfodiester 1 3 Sintesis de fosfotriester 1 4 Sintesis de triester fosfito 2 Sintesis por medio del metodo de fosforamiditos 2 1 Bloques de construccion 2 1 1 Fosforamiditos de nucleosidos 2 1 2 Nucleosidos no fosforamiditos 2 2 Ciclo sintetico 2 2 1 Paso 1 El desbloqueo detritilacion 2 2 2 Paso 2 Union 2 2 3 Paso 3 taponado 2 2 4 Paso 4 oxidacion 2 3 Soporte solido 2 3 1 Material de soporte solido 2 3 2 Quimica enlazadora 2 4 Fosforotioatos de oligonucleotidos y su sintesis 2 5 Automatizacion 2 6 Sintesis de medio a largo plazo de la sintesis de oligonucleotidos Historia 2 7 Sintesis de los microarreglos de oligonucleotidos 3 Procesamiento post sintetico 4 Caracterizacion 5 Vease tambien 6 Referencias 7 Mas lecturas 8 Enlaces externos 9 Vease tambienHistoria EditarLa evolucion de la sintesis de oligonucleotidos ha visto cuatro metodos principales de formacion de los enlaces internucleosidicos y ha sido revisada en la literatura con gran detalle 2 3 4 Primeros trabajos y sintesis contemporanea de H fosfonato Editar A principios de la decada de 1950 el grupo de Alexander Robert Todd fue pionero en los metodos de H fosfonato y triester de fosfato para la sintesis de oligonucleotidos 5 6 La reaccion de los compuestos 1 y 2 para formar el diester de H fosfonato 3 es una reaccion de copulacion en solucion mientras que la de los compuestos 4 y 5 para dar 6 es una copulacion fosfotriester ver sintesis fosfotriester mas abajo Treinta anos mas tarde este trabajo inspiro independientemente a dos grupos de investigacion para adoptar la quimica del H fosfonato a la sintesis de fase solida usando monoesteres H fosfonato de nucleosidos 7 como bloques de construccion y cloruro de pivaloilo cloruro de 2 4 6 triisopropilsulfonilo TPS Cl y otros compuestos como activadores 7 8 La implementacion practica del metodo del H fosfonato resulto en un ciclo sintetico muy corto y simple consistiendo de solo dos etapas detritilacion y copulacion Esquema 2 La oxidacion de los enlaces diester H fosfonato internucleosidicos en 8 a enlaces fosfodiester en 9 X O con una solucion de yodo en piridina acuosa es llevada a cabo al final del ensamblado de la cadena como un paso en el ciclo sintetico Alternativamente 8 puede ser convertido en el fosforotioato 10 9 10 11 12 o en fosforoenolato 11 X Se 13 o oxidado por CCl4 en presencia de aminas primarias o secundarias a analogos de fosforamidato 12 14 15 El metodo es muy conveniente en varios tipos de modificaciones de fosfato fosfato fosforotioato fosforamidato y puede ser introducido al mismo oligonucleotido para la modulacion de sus propiedades 16 17 18 Muy a menudo la construccion de bloques de H fosfonato esta protegida en el grupo 5 hidroxi y en el grupo amino de las bases nitrogenadas Adenina Citosina y Guanina de la misma manera que los bloques de construccion de la fosforamidita ver abajo Sin embargo la proteccion del grupo amino no es obligatoria 19 20 Esquema 1 i N Chlorosuccinimida Bn CH2Ph Esquema 2 Sintesis de oligonucleotidos por el metodo de H fosfanato Sintesis de fosfodiester Editar Esquema 3 Union de oligonucleootidos por el metodo de fosfodiester Tr CPh3 En la decada de 1950 Har Gobind Khorana y sus colaboradores desarrollaron un metodo de fosfodiester donde el 3 O acetilnucleosido 5 O fosfato 2 Esquema 3 se activaba con N N diciclohexilcarbodiimida DCC o cloruro de 4 toluensulfonilo Ts Cl y un nucleosido 5 O protegido 1 se hizo reaccionar con la especie activada para dar un monofosfato de dinucleosido protegido 3 21 Tras la eliminacion del grupo acetilo 3 O usando hidrolisis alcalina se llevo a cabo una posterior elongacion de la cadena Siguiendo esta metodologia se sintetizaron conjuntos de tri y tetradeoxirribonucleotidos los que fueron convertidos enzimaticamente en oligonucleotidos mas largos lo que permitio la elucidacion del codigo genetico La principal limitacion del metodo del fosfodiester consistia en la formacion de oligomeros de pirofosfato y oligonucleotidos ramificados en el fosfato internucleosidico El metodo parece ser un paso atras desde la quimica mas selectiva descrita anteriormente sin embargo en aquel entonces no habian sido introducidos la mayor parte de grupos protectores de fosfato que hay hoy en dia La falta de una estrategia de proteccion conveniente necesitaba tomar una retirada a una quimica mas lenta y menos selectiva para lograr el objetivo ultimo del estudio 2 Sintesis de fosfotriester EditarEn la decada de 1960 grupos dirigidos por R Letsinger 22 y C Reese 23 desarrollaron una solucion basada en fosfotriester La diferencia que define de la solucion basada en fosfodiester era la proteccion de la entidad fosfato en el bloque constructor 1 Esquema 4 y en el producto 3 con el grupo 2 cianoetilo Esto precluia la formacion de oligonucleotidos ramificados en el fosfato internucleosidico La mayor selectividad del metodo permitio el uso de agentes copulantes y catalizadores mas eficientes 24 25 lo que redujo dramaticamente la duracion de la sintesis El metodo inicialmente desarrollado para la sintesis en fase de solucion fue tambien implementado en poliestireno 26 lo que inicio un esfuerzo de investigacion masivo en sintesis en fase solida de oligonucleotidos y condujo eventualmente a la automatizacion del ensamblaje en las cadenas de oligonucleotidos Esquema 4 Union de oligonucleotidos por el metodo de fosfotriester MMT CPh2 4 MeOC6H4 Sintesis de triester fosfito Editar En la decada de 1970 sustancialmente mas reactivos P III derivados de nucleosidos 3 O clorofosfito fueron usadas de manera exitosa en la formacion de enlaces internucleosidicoss 27 Esto llevo al descubrimiento de la metodologia del triester fosfito El grupo liderado por M Caruthers tuvo la ventaja de tener 1H tetrasolidofosfitos menos agresivos y mas selectivos y por lo tanto implementaron el metodo en una fase solida 28 Poco tiempo despues los trabajadores del mismo grupo mejoraron el metodo usando nucleosidos fosforamiditos mas estables como bloques de construccion 29 El usar 2 cianoetil como grupo protector del fosfito 30 en lugar de un grupo metilo 31 32 mas dificil de usar llevo a los nucleosidos fosforamiditos que se usan actualmente en la sintesis de oligonucleotidos ver los bloques de construccion de fosforamiditos Despues vinieron muchas mejoras en la fabricacion de los bloques de construccion en los sintetizadores de oligonucleotidos y en los protocolos de sintetizacion que hicieron que la quimica de fosforamiditos fuera un metodo muy seguro y facil para la preparacion de oligonucleotidos sinteticos 33 Sintesis por medio del metodo de fosforamiditos EditarBloques de construccion Editar Fosforamiditos de nucleosidos Editar Fosforamiditos 2 desoxinucleosidos protegidos Como fue mencionado previamente los nucleotidos de origen natural nucleosido 3 o fosfatos 5 y sus analogos de fosfodiester no son lo suficientemente reactivos para poder llevar a cabo la aceleracion de la preparacion sintetica de oligonucleotidos en altos rendimientos La selectividad y el tipo de formacion de los enlaces internucleosidicos aumenta drasticamente al usar 3 O N N diisopropil fosforamidita derivados de nucleosidos fosforamiditos de nucleosidos que tienen una funcion de bloques de construccion en el metodo de triester fosfito Para prevenir una reaccion secundaria no deseada todos los demas grupos funcionales presentes en los nucleosidos tienen que ser no reactivos protegidos uniendo grupos protectores Despues de que el ensamblado de la cadena de oligonucleotidos ha sido completada todos los grupos protectores son removidos para dar lugar a los oligonucleotidos deseados A continuacion se muestran los grupos protectores usados actualmente que se encuentran disponibles comercialmente 34 35 36 37 y los fosforamiditos de nucleosidos mas comunes en los bloques de construccion El grupo 5 hidroxilo esta protegido por un grupo acido labil DMT 4 4 dimetoxitritil Timina y uracilo bases nitrogenadas de timidina y uridina respectivamente no tienen grupos amino exociclicos y por lo tanto no requieren ninguna proteccion La guanosina y la 2 deoxiguanosina tienen un grupo amino exociclico su basicidad es baja al grado en el que no reacciona con fosforamiditos bajo las condiciones de una reaccion de copulacion Sin embargo un fosforamidito derivado de N2 no protegido 5 O DMT 2 desoxiguanosina es poco soluble en acetonitrilo el solvente que es comunmente usado en la sintesis de oligonucleotidos 38 En contraste las versiones de N2 protegidas del mismo compuesto son solubles en acetonitrilo y por lo tanto son muy usadas Las bases nitrogenadas adenina y citosina tienen grupos amino exociclicos reactivos con los fosforamiditos activados bajo las condiciones de una reaccion de copulacion Bajo el uso de pasos adicionales en el ciclo de sintetizacion 39 40 o agentes alternativos de copulacion y sistemas de solvatacion 38 el ensamblaje de la cadena de oligonucleotidos se puede llevar a cabo usando dA y dC fosforamiditos con grupos amino no protegidos Sin embargo estos intentos se encuentran actualmente en el campo de investigacion La sintesis de oligonucleotidos los grupos amino exociclicos en los nucleosidos son protegidos permanentemente en todo el proceso de ensamblaje de la cadena de oligonucleotidos La proteccion de los grupos amino exociclicos tiene que ser ortogonal al grupo 5 hidroxilo porque el ultimo es removido al final de cada ciclo sintetico La estrategia mas facil de implementar y por lo tanto la mas aceptada es en la que los grupos aminos exociclicos tienen una proteccion base labil Lo mas comun es usar dos esquemas de proteccion En la primera el esquema estandar y mas robusto Figura proteccion de Bz benzonil es usada para A dA y dC mientras que G y dG son protegidas por un grupo isobutritil Recientemente el grupo Ac acetilo ha sido usado para proteger C y dC como se muestra en la figura 41 En la segunda en el esquema leve de proteccion A y dA son protegidos con grupos de isobutritil 42 o fenoxiacetil PAC 43 C y dC tienen proteccion de acetil 41 y G y dG son protegidos con grupos de 4 isopropilfenoxiacetil Pr PAC 44 o dimetilformamidino dmf 45 Los grupos de proteccion leve son removidos mas facilmente que los grupos de proteccion estandar Sin embargo los fosforamiditos que contienen estos grupos son menos solubles cuando estan almacenados en solucion El grupos fosfito es protegido por un grupo de base labil 2 cianoetil 32 Una vez que un fosforamidito ha sido unido al soporte solido de oligonucleotidos y los restos del fosfato se han convertido en especies P V la presencia de la proteccion del fosfato no es necesaria para que las reacciones de copulacion se lleven a cabo de manera exitosa 46 En la sintesis de RNA el grupo 2 hidroxilo es protegido por el grupoTBDMS t butildimetilsilil 47 48 49 50 o con el grupo TOM tri iso propilsililoximetil 51 52 los dos pueden ser removidos con un tratamiento del ion floruro Los restos del fosfito tambien tienen al diisopropil amino Pr2N reactivo bajo condiciones acidas Cuando se activa el grupo diisopropilamino se va para ser sustituido por el grupo 5 hidroxilo que esta unido al soporte del oligonucleotido ver paso 2 union en la parte de abajo 2 O ARN fosforamiditos de nucleosidos protegidos Nucleosidos no fosforamiditos Editar Fosforamiditos no nucleosidos para la modificacion 5 de los oligonucleotidos sinteticos MMT mono metoxitritil 4 metoxifenil difenilmetilLos nucleosidos no fosforamiditos son los reactivos de fosforamiditos que estan disenados para introducir diversas funciones en los extremos de los oligonucleotidos sinteticos o entre los residuos de los nucleotidos a la mitad de una secuencia Para poder ser introducidos en una secuencia un modificador no nucleosidico tiene que tener por lo menos 2 grupos hidroxilos uno de ellos suele estar protegido por el grupo DMT mientras que el otro contiene los restos del fosforamidito reactivo Los fosforamitos no nucleosidicos son usados para introducir los grupos deseados que no estan disponibles en los nucleosidos naturales o que pueden ser introducidos de manera mas facil usando disenos quimicos mas simples En el esquema para la demostracion de la diversidad estructural y funcional disponible se puede ver una pequena seleccion de reactivos de fosformaidito comercial Estos reactivos sirven para la union del fosfato 5 terminal 1 53 NH2 2 54 SH 3 55 aldehido 4 56 y grupos carboxilicos 5 57 CC triples enlaces 6 58 marcadores no radioactivos y desactivadores ejemplificados por 6 FAM amidita 7 59 para la fijacion de fluoresceina y DABCYL amidita 8 60 respectivamente modificadores hidrofilicos e hidrofobicos ejemplificados por hexaetilenglicol amidita 9 61 62 y colesterol amidita 10 63 respectivamente y amidita biotina 11 64 Ciclo sintetico EditarLa sintesis de oligonucleotidos se lleva a cabo por una adicion gradual de residuos de nucleotidos al extremo 5 de la cadena creciente hasta que la secuencia deseada sea ensamblada Cada adicion tiene que ver con un ciclo sintetico esquema 5 y consiste en cuatro reacciones quimicas Esquema 5 Ciclo sintetico para la preparacion de oligonucleotidos por el metodo de foforamiditos Paso 1 El desbloqueo detritilacion Editar El grupo DMT es removido con la solucion de un acido puede ser 2 de acido tricloroacetico TCA o 3 de acido dicloroacetico DCA en una solucion inerte diclorometano o tolueno El cation DMT de color naranja es destenido el resultado de este paso es un oligonucleotido solido unido al soporte que contiene una terminal 5 hidroxilo libre Es importante recordar que llevar a cabo una detritilacion por un largo periodo de tiempo o con soluciones de acidos mas fuertes de las recomendadas puede llevar a una depurinacion del soporte solido ligado al oligonucleotido y por lo tanto reduce el rendimiento del producto deseado Paso 2 Union Editar Una solucion de 0 02 0 2 M de fosforamidito de nucleosido o una mezcla de varios fosforamiditos en acetonitrilo es activado por una solucion 0 2 0 7 M de un catalizador azol acido 1H tetrazol 5 ethylthio 1H tetrazole 65 2 benzylthiotetrazole 66 67 4 5 dicyano imidazol 68 o otros compuestos similares En un analisis reciente se puede encontrar mayor informacion en el uso de varios agentes de union en la sintesis de oligonucleotidos 69 La mezcla suele ser muy corta y ocurre en las lineas de fluido de los sintetizadores de oligonucleotidos ver abajo mientras que los componentes son entregados a los reactores que contienen el soporte solido La fosforamidita activada en 1 5 20 veces excede el soporte unido al material y es conectado con el soporte de solido del principio primera union o con un soporte unido al oligonucleotido precursor siguientes uniones cuyo grupo 5 hidroxilo reacciona con los restos del fosforamidito activado del nucleosdio del fosforamidito que entra para formar un enlace fosfito triester La union de los fosforamiditos 2 desoxinucleosido es muy rapida y requiere a pequena escala aproximadamente 20 s para poder llevarse a cabo En contraste 2 O protegido de fosforamiditos de ribonucleosido requieren de 5 a 15 minutos para poder ser unidos en sistemas mas complejos 48 70 71 72 La reaccion es muy sensible a la presencia de agua especialmente cuando se usan soluciones diluidas de fosforamiditos y normalmente se lleva a cabo por acetonitrilo anhidrido Generalmente a gran escala en la sintesis el exceso es menor y la concentracion de fosforamiditos es mayor La concentracion del activador es determinada por su solubilidad en acetonitrilo independientemente de la escala de la sintesis Despues de que la union es completada todos los reactivos que no fueron unidos y los productos no deseados se remueven mediante un lavado Paso 3 taponado Editar El paso del taponado se lleva a cabo mediante el tratamiento del soporte solido unido al material con una mezcla de anhidrido acetico y con 1 metilimidazol o menos comun DMAP como catalizadores en el metodo de fosforamiditos Tiene dos propositos Despues de completar la reaccion de union un porcentaje pequeno del soporte de solido unido a grupos 5 OH 0 1 a 1 no reacciona y por lo tanto necesita ser bloqueado permanentemente de la elongacion de la cadena para prevenir la formacion de oligonucleotidos con una delecion de bases internas que se refiere normalmente como n 1 cortameros Los grupos 5 hidroxilos son acetilados por una mezcla de taponado Tambien ha sido reportado que los fosforamiditos que se activan con 1H tetrazol reaccionan con la posicion O6 de la guanosina 73 Despues de la oxidacion con I2 agua el producto secundario posiblemente a traves de la migracion de O6 N7 pasa a la depurinacion Los sitios apurinicos que se forman se rompen facilmente al final de la desproteccion del oligonucleotido bajo las condiciones basicas ver abajo para dar lugar a oligonucleotidos mas cortos y de esta forma reducir el rendimiento del producto completado Las modificaciones de O6 son removidas rapidamente por un tratamiento con el reactivo de taponado siempre y cuando el paso del taponado se lleve a cabo antes de la oxidacion con I2 agua La sintesis de fosfotrioatos de oligonucleotidos OPS ver abajo no se involucra con la oxidacion con I2 agua y por lo tanto no sufre los efectos secundarios de la reaccion que se describe anteriormente Por otro lado si el paso de taponado se lleva a cabo antes de una sulfurizacion el soporte solido puede contener los residuos del anhidrido acetico y de N metilimidazol que quedaron despues del paso de taponado La mezcla de taponado interfiere con la reaccion de transferencia de sulfuro que resulta en la formacion de los enlaces internucleosidicos de fosfato triester en el lugar de los triesteres PS deseados Por lo tanto para la sintesis de OPS es recomendado llevar a cabo el paso de sulfurizacion antes del paso de taponado 74 Paso 4 oxidacion Editar El enlace fosfito tricoordinado que se acaba de formar no es natural y tiene estabilidad limitada bajo las condiciones de la sintesis de oligonucleotidos El tratamiento del soporte unido al material con yodo y agua en presencia de una base debil piridina lutidina o colidina oxida el fosfito triester en un fosfato triester tetracoordinado que es un precursor protegido de un enlace internucleosidico de fosfato diester que ocurre de manera natural La oxidacion puede llevarse a cabo bajo condiciones anhidridas usando terc butil hidroperoxido 75 o mas eficiente 1S 10 camphorsulfonyl oxaziridino CSO 76 77 78 El paso de oxidacion es sustituido con un paso de sulfurizacion para obtener fosfotrioatos de oligonucleotido ver fosfotrioatos de oligonucleotido y su sintesis en la parte de abajo En el ultimo caso el paso de sulfurizacion es mejor si se da antes del taponado Soporte solido Editar En la sintesis de la fase solida el oligonucleotido es ensamblado mediante enlaces covalentes a traves de su terminal 3 del grupo hidroxilo a un soporte soolido de material y restos unido a el durante todo el curso de la cadena de ensamblado El soporte solido esta contenido en columnas cuyas dimensiones dependen en la escala de la sintesis y pueden variar entre 0 05mL y varios litros La mayoria de los oligonucleotidos son sintetizados en una escala pequena que va de los 40nmol a 1mmol Recientemente la sintesis compleja de los oligonucleotidos en donde el soporte solido se encuentra en los pozos de las placas de multiples pozos comunmente 96 o 384 pozos por placa se ha convertido en una opcion para la sintesis paralela de oligonucleotidos en pequena escala 79 Al final de la cadena de ensamblado los oligonucleotidos son liberados del soporte solido y son eluidos de la columna o del pozo Material de soporte solido Editar En contraste con la sintesis de la fase solida organica y la sintesis peptidica la sintesis de oligonucleotidos procede mejor en soportes solidos no hinchables Los dos materiales mas usados en la fase solida son el vidrio de poro controlado CPG y el poliestireno macroporoso MPPS 80 CPG es definido comunmente por su tamano de poro En la quimica de oligonucleotidos los tamanos de poros de 500 1000 1500 2000 y 3000 A se usan para permitir la preparacion de 50 80 100 150 y 200 oligonucleotidos respectivamente Para hacer que el CPG sea adecuado para el procesamiento la superficie del material es tratada con 3 aminopropil trietoxisilano para dar CPG al aminopropil El brazo del aminopropil puede ser extendido para dar lugar a una cadena larga conocida como aminoalkil LCAA CPG El grupo amino se usa como un punto adecuado de anclaje para los enlazadores en la sintesis de oligonucleootidos ver abajo MPPS es adecuado para la sintesis de oligonucleotidos cuando son poco hinchables el poliestireno altamente reticulado es obtenido por la polimerizacion de divinilbenceno min 60 estireno y 4 clorometilestireno en la presencia de un agente poroso Los macroporos de clorometil MPPS obtenidos se convierten en aminometil MPPS Quimica enlazadora Editar Soportes de solido comerciales para la sintesis de oligonucleotidosPara que el material del soporte solido sea adecuado para la sintesis de oligonucleotidos los enlazadores no nucleosidicos o los succionatos de nucleosido deben de estar unidos por un enlace covalente a un grupo amino reactivo como aminopropil CPG LCAA CPG o aminometil MPPS El resto de los grupos aminos que no reaccionaron son cubiertos con anhidrido acetico Hay tres diferentes grupos de soportes de solidos que se usan normalmente Soportes universales En un metodo mas reciente mas conveniente y mas usado la sintesis empieza con el soporte universal en donde un enlazador no nucleosidico es ligado al material del soporte del solido compuestos 1 y 2 Un fosforamito respectivo al residuo de nucleosido de 3 terminal es acoplado al soporte solido universal en el primer ciclo de sintesis en el ensamblaje del oligonucleotido usando los protocolos estandar Despues de esto el ensamblaje de cadena continua hasta que es completado y entonces el solido de soporte es unido al oligonucleotido es desprotegido La caracteristica distintiva del solido de soporte universal es que la liberacion de los oligonucleotidos ocurre debido a la escision hidrolitica de un enlace P O que conecta el 3 O de la 3 terminal del residuo del nucleotido al enlazador universal como se muestra en el esquema 6 La ventaja critica de este enfoque es que el mismo solido de soporte es usado sin importar la secuencia de los oligonucleotidos que se desean sintetizar Para remover por completo el enlazador y el fosfato 3 terminal del oligonucleotido ensamblado el solido de soporte 1 y varios solidos de soporte similares 81 requieren amonio gaseoso 82 hidroxido de amonio acuoso metilamina acuosa 83 o su mezcla 84 y estan comercialmente disponibles 85 86 El soporte solido 2 87 requiere una solucion de amonia en metanol anhidrido y tambien esta comercialmente disponible 88 89 Soportes solidos nucleosidicos En un primer acercamiento el grupo 3 hidroxilo del residuo del nucleosido 3 terminal se une al soporte solido a traves de 3 O succinil como un compuesto 3 El ensamblaje de la cadena del oligonucleotido empieza con la union de un bloque de construccion de fosforamidita al segundo residuo de nucleotido de 3 terminal El grupo hidroxilo 3 terminal en oligonucleotidos sintetizados en soportes de solido nucleosidicos son desprotegidos bajo ciertas condiciones que son mas ligeras que aquellas que aplican para los soportes de solidos universales Sin embargo el hecho de que un soporte de solido nucleosidico tenga que ser seleccionado en una secuencia especifica reduce la complejidad del proceso sintetico e incrementa la posibilidad del error humano Soportes solidos especiales Son usados como para la adjuncion de los grupos funcionales deseados en la 3 terminal de los oligonucleotidos sinteticos Por ejemplo el soporte de solido comercial 90 el soporte solido 4 91 permite la preparacion de oligonucleotidos que contienen en su 3 terminal enlazador 3 aminopropil De manera similar a los fosforamiditos no nucleosidicos hay otros soportes de solidos disenados para la fijacion de grupos funcionales reactivos grupos locutores no reactivos y modificadores terminales por ejemplo colesterol o otras ataduras hidrofobicas y adecuados a varias aplicaciones que estan comercialmente disponibles Informacion mas detallada en varios soportes de solidos para la sintesis de oligonucleotidos pueden encontrarse en un repaso reciente 79 Esquema 6 Mecanismo de 3 desfosforilacion de oligonucleotidos ensamblados en un soporte de solido universal Fosforotioatos de oligonucleotidos y su sintesis Editar Enlaces Sp y Rp diasteromeros internucleosidicos de fosforotioato Los fosforotioatos de oligonucleotidos OPS son oligonucleotidos modificados en donde uno de los atomos de oxigeno en los restos del fosfato es reemplazado por un azufre Solamente los fosforotioatos que tienen sulfuro en una posicion en la que no se juntan como se muestra en la figura son muy usados y estan disponibles comercialmente El reemplazo del oxigeno que no une con el sulfuro crea un nuevo centro quiral en el fosforo En el caso de un dinucleotido esto resulta en la formacion de un diasteromero de monofosforotioatos Sp y Rp dinucleosidos cuyas estructuras se muestran en la figura En un oligonucleotido n mer donde todos los n 1 enlaces internucleosidicos son enlaces de fosforotioato el numero de diasteromeros m es calculado com m 2 n 1 Como son analogos de acidos nucleicos no naturales los OPS son sustancialmente mas estables en la hidrolisis de nucleasas las enzimas que se encargan de destruir acidos nucleicos al romper los puentes del enlace P O en la mitad del fosfodiester Esta propiedad determina el uso de OPS como oligonucleotidos antisentido in vitro y en vivo aplicaciones donde la amplia exposicion a las nucleasas es inevitable De manera similar para mejorar la estabilidad de los siRNAs al menos un enlace de fosforotiato es introducido en la terminal 3 en las hembras de ambos sentidos y de antisentido En cuanto a la quiralidad los OPS puros todos los diasteromeros Sp son mas estables a la degradacion enzimatica que sus analogos Rp 92 Sin embargo la preparacion de la quiralidad de los OPS puros sigue siendo un reto sintetico 12 93 En las practicas de laboratorio diferentes mezclas de diasteromeros de OPS son usadas normalmente La sintesis de los OPS es muy parecida a la de los oligonucleotidos naturales La diferencia es que el paso de oxidacion es reemplazado por una transferencia de sulfuro sulfuracion y que el sistema de taponado es llevado a cabo hasta despues de la sulfuracion Solo hay 3 reactivos reportados capaces de llevar a cabo la transferencia de sulfuro eficiente y que esten comercialmente disponibles Agentes de transferencia de azufre comerciales para la sintesis de oligonucleotidos 3 Dimethylaminomethylidene amino 3H 1 2 4 dithiazole 3 thione DDTT 3 provee cinetica rapida de sulfuracion y alta estabilidad en la solucion 74 94 95 El reactivo esta disponible de varias fuentes 96 97 3H 1 2 benzodithiol 3 one 1 1 dioxide 4 98 99 tambien conocido con el reactivo de Beaucage tiene una mejor solubilidad en acetonitrilo y tiempos cortos de reaccion Sin embargo el reactivo en solucion tiene una estabilidad limitada y es menos eficiente en los enlaces de sulforizacion de RNA 94 95 N N N N Tetraethylthiuram disulfide TETD es soluble en acetonitrilo y es comercialmente disponible 100 Sin embargo la reaccion de sulfurizacion de un enlace internucleosidico de DNA con TETD requiere 15 minutos 101 lo que es mas de 10 veces mas lento que en los compuestos 3 y 4 Automatizacion Editar En el pasado la sintesis de oligonucleotidos se llevaba a cabo manualmente en solucion o en fase solida La sintesis de la fase solida fue implementada usando como contenedores de la fase solida columnas de vidrio miniatura similares en la forma de columnas de cromatografia de baja presion o jeringas con filtros porosos 102 Actualmente la sintesis de oligonucleotidos en fase solida se lleva a cabo de manera automatica usando instrumentos controlados por computadora sintetizadores de oligonucleotidos y son tecnicamente implementados en formatos de columna placa de pozos multiples y de arreglos El formato de columna funciona mejor en la investigacion y en aplicaciones a grande escala cuando la sintesis no es compleja 103 El formato de la placa de pozos multiples esta disenado especificamente para la sintesis compleja en una escala pequena para satisfacer la creciente demanda de la industria y academica para la sintesis de oligonucleotidos 104 Se encuentran disponibles comercialmente un numero de sintetizadores de oligonucleotidos para una sintesis a pequena escala 105 106 107 108 109 y tambien para la sintesis de mediana a larga escala 110 Sintesis de medio a largo plazo de la sintesis de oligonucleotidos Historia Editar Los sintetizadores de oligonucleotidos a larga escala eran desarrollados con frecuencia aumentando las capacidades de una plataforma de instrumentos preexistente En 1980 surgio uno de los primeros sintetizadores a mediana escala fue fabricado por la compania Biosearch en Novato CA 8800 Esta plataforma fue originalmente disenada como un sintetizador de peptidos y su usaba un reactor de lecho de fluido esencial para el alojamiento de las caracteristicas de hinchamiento de poliestireno en los soportes utilizados en la metodologia de Merrifield La sintesis de oligonucleotidos involucra el uso de CPG vidrio de poro controlado que es un soporte rigido mas adecuado para los reactores de columna que se describen en la parte de arriba La escala de 8800 estaba limitada al flujo requerido para fluidizar el soporte Algunos de los disenos de los reactores de novel asi como que las presiones estuvieran por arriba de lo normal permitian al 8800 alcanzar escalas que podian preparar 1mmol de oligonucleotidos A mediados de los anos 1990 varias companias desarrollaron plataformas basadas en liquidos de cromatografia preparativas y semi preparativas Estos sistemas eran adecuados para un enfoque de reactor de columna En la mayoria de los casos lo unico que se requeria era aumentar el numero de fluidos que podian ser entregados a una columna La oligo sintesis requiere un minimo de 10 y los liquidos de cromatografia normalmente acomodan 4 Esto era una tarea de diseno facil y algunas estrategias semi automaticas funcionaban sin hacer ninguna modificacion al equipo LC que ya existia PerSeptive Biosystems y Pharmacia GE eran 2 de las muchas companias que desarrollaron sintetizadores a partir de cromatografias liquidas Genomic Technologies Inc 111 era una de las pocas companias que desarrollo sintetizadores de oligonucleotidos a larga escala La plataforma inicial llamada VLSS que significa sintetizadores a muy grande escala por sus siglas en ingles utilizaba columnas de cromatografia liquida como reactores y podia sintetizar hasta 75 milimoles de material Muchas fabricas de sintesis de oligonucleotidos disenaban y producian sus propias plataformas y por eso se conoce poco de estas El diseno VLSS continuo perfeccionandose y continua en el sintetizador Qmaster 112 que es una plataforma a pequena escala que produce cantidades de miligramos a gramos de oligonucleotidos sintetizados Las practicas actuales de la sintesis de los oligonucleotidos quimicamente modificados a larga escala han sido revisados recientemente 113 Sintesis de los microarreglos de oligonucleotidos Editar El microarreglo de un oligonucleotido puede ser visto como una placa de pozos multiples en donde las paredes que dividen los pozos son removidos intencionalmente Con respecto a la parte quimica la sintesis de los microarreglos de oligonucleotidos es diferente a la sintesis de oligonueclotidos convencional en dos cosas principales Los oligonucleotidos permanecen unidos a la fase solida de manera permanente lo que requiere el uso de enlazadores que sean estables bajo las condiciones del final del procedimiento de desproteccion Es necesario usar tecnicas de sitio selectivo de 5 desproteccion al considerar las siguientes razones la ausencia de divisores fisicos entre los sitios ocupados por los oligonucleotidos individuales un espacio muy limitado en la superficie del microarreglo una secuencia de oligonucleotido ocupa un cuadrado de 25 25 mm 114 y el requerimiento de alta fidelidad de la sintesis del oligonucleotido En un enfoque cuando el grupo 5 O ODMT es removido se ve efectuado por una generacion electroquimica del acido en los sitios requeridos 115 Otro enfoque usa 5 O a metil 6 oxicarbonilo piperonilo nitro MeNPOC como grupo protector el cual puede ser removido con radiacion de luz UV a 365 nm de longitud de onda 114 5 O MeNPOC nucleosido protegido de fosforamiditoProcesamiento post sintetico EditarDespues de que el ensamblaje de la cadena es completado el soporte solido unido al oligonucleotido esta totalmente protegido El grupo 5 terminal 5 hidroxilo es protegido por el grupo DMT Los restos del fosfato internucleosidico o fosforotrioato estan protegidos por los grupos 2 cianoetilo Los grupos amino exociclicos en todas las bases nitrogenadas excepto en T y U estan protegidos por grupos protectores acilo Para que el oligonucleotido sea funcional todos los grupos protectores deben ser removidos La base N acil de proteccion y el 2 cianoetil fosfato de proteccion pueden ser removidos simultaneamente con el tratamiento de bases inorganicas o de aminas Sin embargo la aplicabilidad de este metodo esta limitada por el hecho de que la hendidura del 2 cianoetilo fosfato de proteccion lleva a la formacion de acrilonitrilo como un producto secundario Bajo las condiciones basicas que se requieren para remover la proteccion del N acilo el acrilonitrilo es capaz de una alquilacion de bases nitrogenadas principalmente en la posicion N3 de los residuos de la timina y el uracilo para dar lugar a los respectivos aductos de N3 2 cianoetil a traves de la reaccion de Michael La formacion de estos productos secundarios puede ser evitada tratando a los oligonucleotidos unidos al soporte solido con soluciones de bases en un solvente organico por ejemplo con 50 trietilamina en acetonitrilo 116 o con 10 de dietilamina en acetonitrilo 117 Este tratamiento es muy recomendado para las preparaciones de mediana y gran escala y es opcional para la sintesis de pequena escala donde la concentracion generada de acrilonitrilo en la desproteccion es baja Independientemente de si los grupos protectores de fosfato son removidos primero los oligonucleotidos unidos al soporte solido son desprotegidos usando uno de los dos enfoques generales 1 A menudo el grupo 5 DMT es removido al final del ensamblaje de la cadena de oligonucleootidos Los oligonucleotidos son liberados de la fase solida y desprotegidos base y fosfato por tratamiento con hidroxido de amonio acuoso metilamina acuosa sus mezclas 41 amonio gaseoso o metilaminane 118 o menos comun soluciones de otras aminas primarias o alcalis a temperatura ambiente o elevada Esto remueve toda la proteccion que quedaba en los grupos de 2 desoxioligonucleotidos resultando una mezcla que contiene el producto deseado Si los oligonucleotidos contienen residuos de ribonuleotidos 2 O protegidos el protocolo para la desproteccion incluye un segundo paso en el que el 2 O protector de grupos sillyl son removidos mediante un tratamiento con ion floruro a traves de varios metodos 119 El producto totalmente desprotegido puede ser usado asi o el oligonucleotido puede ser purificado por varios metodos El mas comun es cuando el producto crudo es desalinizado usando precipitacion de etanol cromatografia por exclusion de tamano o HPLC de fase reversa Para eliminar productos de truncacion no requeridos los oligonucleotidos pueden ser purificados mediante electroforesis en gel de poliacrilamida o de intercambio anionico HPLC seguido de desalinizacion 2 El segundo enfoque solamente es usado cuando el metodo de purificacion es HPLC de fase reversa En este caso el grupo 5 terminal DMT que sirve como manija hidrofobica para purificacion permanece hasta el final de la sintesis El oligonucleotido es desprotegido bajo las condiciones basicas descritas anteriormente y a partir de una evaporacion es purificado mediante una HPLC de fase reversa El material recolectado es posteriormente detritilacion bajo condiciones acidas acuosas En una pequena escala menos de 0 01 0 02mmol se usa el tratamiento con 80 de acido acetico acuoso durante 15 30 minutos a temperatura ambiente seguido por una evaporacion de la mezcla Finalmente el producto es desalinizado como fue descrito anteriormente Para algunas aplicaciones grupos informadores adicionales pueden estar unidos a un oligonucleotido usando una variedad de procedimientos post sinteticos Caracterizacion Editar Deconvulcion ES MS de un oligonucleotido crudo 5 DMT T20 masa calculada 6324 26 Da Asi como con cualquier otro compuesto organico es prudente caracterizar oligonucleotidos sinteticos segun su preparacion En casos mas complejos investigacion y sintesis a gran escala los oligonucleotidos se caracterizan por su desproteccion y su purificacion A pesar de que el enfoque principal de la caracterizacion es la secuenciacion una rutina relativamente economica las consideraciones en la reduccion de costos evitan su uso en la rutina de la fabricacion de oligonucleotidos En la practica del dia a dia es suficiente con obtener la masa molecular de un oligonucleotido mediante el registro de su espectro de masa Hay dos metodos que son usados en la caracterizacion de oligonucleotidos electrospray de espectometria de masa ES MS y laser asistido por matriz de desorcion espectrometria de masas de ionizacion de tiempo de vuelo MALDI TOF Para obtener el informe de espectro es muy importante cambiar todos los iones de metal que puedan estar presentes en la muestra de iones de amonio o de tetraalquilamonio antes de someter una muestra al analisis por cualquiera de los metodos mencionados En un espectro ES MS un oligonucleotido en especifico genera una serie de iones que corresponden a diferentes estados de ionizacion del compuesto En consecuencia el oligonucleootido con masa molecular M genera iones con masas M nH n donde M es la masa molecular del oligonucleotido en forma de un acido libre todas las cargas negativas de los grupos fosfodiester internucleosidicos son neutralizados con H n es el estado de ionizacion y H es la masa atomica del hidrogeno 1 Da Los iones con un rango n de 2 a 5 son mas utiles para la caracterizacion Recientemente el software suministrado con los instrumentos fabricados es capaz de llevar a cabo un procedimiento de deconvolucion lo que significa que encuentra picos de iones que pertenecen al mismo conjunto y que deriva la masa molecular del oligonucleotido Para obtener informacion mas detallada de la impureza del perfil de los oligonucleotidos se usa la cromatografia liquida de masa LC MS o HPLC MS 120 o electroforesis capilar de espectometria de masa CEMS 121 Vease tambien EditarAcidos nucleicos Analogos de acidos nucleicos Acido peptidonucleicoReferencias Editar Beaucage S Iyer R 1992 Advances in the Synthesis of Oligonucleotides by the Phosphoramidite Approach Tetrahedron 48 2223 doi 10 1016 S0040 4020 01 88752 4 a b Brown D M A brief history of oligonucleotide synthesis Methods in Molecular Biology Totowa NJ United States 1993 20 Protocols for Oligonucleotides and Analogs 1 17 Reese Colin B 2005 Oligo and poly nucleotides 50 years of chemical synthesis Organic amp Biomolecular Chemistry 3 21 3851 doi 10 1039 b510458k Iyer R P Beaucage S L 7 05 Oligonucleotide synthesis In Comprehensive Natural Products Chemistry Vol 7 DNA and Aspects of 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