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MALDI-TOF

Agosto 15, 2022

Se denomina MALDI por sus siglas en inglés Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization (desorción/ionización láser asistida por matriz) y TOF por el detector de iones que se acopla al MALDI y cuyo nombre procede también de sus siglas en inglés Time-Of-Flight.[1]​[2]​

Figura 1. Espectrómetro de masas MALDI-TOF.

Técnica desarrollada en 1987 por el ingeniero japonés Koichi Tanaka.[3]​ Consiste en una ionización suave del analito que provoca la vaporización de intactas moléculas termolábiles, no volátiles tales como proteínas y lípidos en un rango de peso molecular entre 2 a 20 kDa, a un relativo bajo costo y resultado inmediato.[4]​[5]​

Muy utilizada para obtener, mediante espectrometría de masas, un espectro propio de un organismo y comparándolo con bases de datos, identificar a nivel de género, especie e incluso cepa aislados bacterianos y fúngicos. También es posible identificar virus.[1]​[5]​

Antecedentes

Desde su creación, la espectrometría de masas (MS) fue un método altamente complejo y relegado por varias décadas al análisis de perfiles proteicos en laboratorios de hematología y química. En 1975, Anhalt & Fenselau (Anhalt & Fenselau, 1975) usaron extractos bacterianos de distinto género y especie para obtener espectros de masa únicos y de esta manera identificar por primera vez microorganismos usando MS. Cinco años más tarde se empezaron las técnicas de desorción/ionización que abarcaban la desorción por plasma, desorción por láser y bombardeo atómico rápido que ionizan analitos biomoleculares con lo cual los estudios se dirigieron a obtener perfiles bacterianos aunque el aquel tiempo se limitaba al uso de moléculas de bajo peso molecular.[6]​[7]​

El problema con los espectros obtenidos al aplicar luz láser a las muestras era que el espectro obtenido era de muy baja intensidad; luego se descubrió que cuando el analito era mezclado con una matriz orgánica la luz láser era absorbida más eficientemente y consecuentemente se obtenían espectros de mayor intensidad. Comenzó entonces la época de las técnicas basadas en ionización suave tales como la Desorción/ionización por láser asistida en matriz (MALDI) y Ionización por electrospray (ESI) que permitieron, vía MS, obtener perfiles proteicos en un rango de peso molecular bastante amplio así como de moléculas sin fragmentación.[6]​

El analizador que más comúnmente se acopla a la fuente MALDI es el analizador de tiempo de vuelo (TOF) con lo cual nace el nombre de MALDI-TOF.

Holland y colaboradores (1996) mostraron que era posible obtener huellas espectrales MALDI-TOF usando como analitos células bacterianas enteras sin tratamiento previo a la espectrometría de masas. Más tarde se reportaría que es posible obtener perfiles proteicos usando MALDI-TOF a partir de una purificación posterior a una extracción celular.[8]​[9]​[10]​

Desde la última década del siglo XX se ha incrementado notablemente el número de publicaciones que emplean MALDI-TOF como herramienta de identificación fúngica, vírica y bacteriana donde se ha llegado incluso a nivel de cepa, porque relativamente no es costosa y bastante rápida.

Mecanismos y componentes de la espectrometría de masas MALDI-TOF (MALDI-TOF MS)

De manera general, el método de ionización a ser utilizado depende de la naturaleza de la muestra (mezclas simples/complejas, proteínas, lípidos, polisacáridos, entre otros) y del objetivo que busque el estudio (identificación de microorganismos, identificación de proteínas, cuantificación y biotyping o biotipaje), MALDI-TOF junto con ESI ofrecen una ionización suave que mantiene intacto el analito desde la ionización hasta su conversión a fase gaseosa.[11]​

Para llevar a cabo el análisis, sobre una placa metálica conductora se mezcla la muestra con una matriz orgánica para lograr una cocristalización muestra-matriz. En alto vacío, es tratada con pulsos de luz láser provocando que la matriz absorba esta energía y la convierta en energía de excitación y transferencia de iones al analito. El área tratada se calienta y se provoca la desorción de iones de fase sólida a gaseosa.[12]​ Según Croxatto, Prod’hom & Greub (2012) un espectrómetro de masas se divide en tres unidades funcionales.[1]​ (Figura 2):

  • Una fuente para ionizar la muestra y transferirla a fase gaseosa.
  • Un analizador de masas: comúnmente se utiliza el analizador TOF (time of flight) que mide muy precisamente el tiempo de vuelo de los iones desde que son acelerados, por la fuente, hasta que impactan el detector.
  • Un dispositivo de detección de los iones separados.
 
Figura 2. Espectrometría de masas MALDI-TOF. Luego de que el analito y la matriz cocristalizan, se ingresa la placa metálica al espectrómetro de masas donde es bombardeada por pulsos de luz láser para producir la desorción e ionización de las moléculas que son aceleradas por medio de un campo electrostático. En el analizador TOF, los iones más pequeños viajan más rápidamente que los iones más grandes. El detector recepta los iones y como resultado se produce un espectro, específico para cada analito, que se compara con una base de datos parja la identificación de género, especie o cea. Imagen modificada de Croxatto et al. (2012).

Aplicaciones

Identificación microbiana y vírica

Históricamente la confirmación de la identificación de microorganismos ha seguido fundamentada en ensayos jerárquicamente dependientes: (1) aislamiento, pruebas basadas en tinciones y morfología microscópica, (2) cultivos en medio sólido o líquido para propagar el organismo de interés, (3) pruebas bioquímicas y antigénicas dirigidas al fenotipo y metabolismo microbiano y con el apoyo de manuales bacteriológicos, llegar a la identificación, y (4) principalmente cuando la identificación tiene una aplicación clínica se prueba susceptibilidad a antibióticos para optar por el mejor tratamiento. Lamentablemente, los resultados dependen de la tasa de crecimiento del microorganismo por lo que pueden llegar a tardar semanas.[1]​

Años después se establecieron técnicas moleculares basadas en la secuenciación de barcodes, 16S para bacterias y 18S para hongos; no obstante, es bien conocido que en este tipo de técnicas es necesaria instrumentación especializada y una zona del laboratorio específica. Para la mayoría de laboratorios no es rentable tener una zona dedicada a la secuenciación; por tanto, la identificación basada en análisis fenótipico de los microorganismos, e.g. MALDI-TOF, se perfila como la preferida a la hora de identificación rutinaria.[1]​[13]​

La identificación bacteriana usando MALDI-TOF no ha presentado mayor inconveniente, salvo algunas especies. Los dermatofitos son hongos que crecen en superficies queratinizadas como en el cabello, piel y uñas. Debido a su compleja estructura filamentosa no ha sido sencilla su identificación por MALDI-TOF. De entre diez estudios focalizados a la identificación de dermatofitos usando MALDI-TOF, Karabicak et al. (2015) reportaron el resultado más bajo (13.5 %), mientras que Erhard et al. (2008) obtuvieron un 99,9 %.[14]​[15]​ Luego de analizar minuciosamente estos resultados L’Ollivier & Ranque (2016) concluyeron que los pasos críticos son: (i) la extracción de proteínas, para la cual es necesario hacerlo por el método del ácido fórmico/acetonitrilo y (ii) una base de datos confiable.[5]​

Búsqueda de biomarcadores para el diagnóstico de enfermedades

Las herramientas de diagnóstico de diabetes mellitus tipo 2 incluyen la prueba de tolerancia a glucosa (OGTT), glucosa en sangre (FBG) y hemoglobina glicosilada (HbA1c). Meng et al. (2016) tomaron en cuenta que estas pruebas proveen marcadores “retrospectivos” y por tanto no podían ser aplicados como predictivos y reportaron la caracterización, usando MALDI-TOF, de 6 péptidos (peaks m/z 1452.9, 1692.8, 1946.0, 2115.1, 2211.0 y 4053.6) como potenciales biomarcadores para el diagnóstico de la diabetes mellitus tipo 2. Posteriormente, realizaron un modelo diagnóstico basado en análisis de regresión logística y curva ROC, obteniendo una precisión de 82.2 %, sensibilidad de 82.5 %, y especificidad de 77.8 %.[16]​

Perspectivas

Los laboratorios de investigación optan muy preferentemente por la secuenciación de barcodes como herramienta para la identificación microbiana; sin embargo la implementación de la espectrometría de masas MALDI-TOF y el crecimiento exponencial de las bases de datos permitirán a los laboratorios clínicos una identificación microbiana muy rápida y a bajo costo. Tomando en cuenta la crisis que se avecina por el abuso de antibióticos, estas ventajas son aspectos claves para un pronto tratamiento a los pacientes.

En el futuro los espectrómetros de masa estarán automatizados para llevar a cabo un test antibiótico y por lo tanto una parcial o completa caracterización microbiana que en la actualidad podría tomar varios días como se mencionó anteriormente. A mediano plazo podría no ser necesario el cultivo de los microorganismos en medio para algunos casos.[2]​

Referencias

  1. ↑ Croxatto, Antony; Prod'hom, Guy; Greub, Gilbert (1 de marzo de 2012). «Applications of MALDI-TOF mass spectrometry in clinical diagnostic microbiology». FEMS Microbiology Reviews (en inglés) 36 (2): 380-407. ISSN 1574-6976. doi:10.1111/j.1574-6976.2011.00298.x. Consultado el 5 de diciembre de 2016. 
  2. ↑ Clark, Andrew E.; Kaleta, Erin J.; Arora, Amit; Wolk, Donna M. (1 de julio de 2013). «Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization–Time of Flight Mass Spectrometry: a Fundamental Shift in the Routine Practice of Clinical Microbiology». Clinical Microbiology Reviews (en inglés) 26 (3): 547-603. ISSN 0893-8512. PMC 3719498. PMID 23824373. doi:10.1128/CMR.00072-12. Consultado el 5 de diciembre de 2016. 
  3. «The 2002 Nobel Prize in Chemistry - Popular Information». www.nobelprize.org. Consultado el 5 de diciembre de 2016. 
  4. Karas, M.; Bachmann, D.; Bahr, U.; Hillenkamp, F. (24 de septiembre de 1987). «Matrix-assisted ultraviolet laser desorption of non-volatile compounds». International Journal of Mass Spectrometry and Ion Processes 78: 53-68. doi:10.1016/0168-1176(87)87041-6. Consultado el 5 de diciembre de 2016. 
  5. ↑ L’Ollivier, Coralie; Ranque, Stéphane (12 de octubre de 2016). «MALDI-TOF-Based Dermatophyte Identification». Mycopathologia (en inglés): 1-10. ISSN 0301-486X. doi:10.1007/s11046-016-0080-x. Consultado el 5 de diciembre de 2016. 
  6. ↑ Shah, Haroun N.; Keys, Carrina J.; Schmid, Oliver; Gharbia, Saheer E. (1 de septiembre de 2002). «Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry and proteomics: a new era in anaerobic microbiology». Clinical Infectious Diseases: An Official Publication of the Infectious Diseases Society of America 35 (Suppl 1): S58-64. ISSN 1537-6591. PMID 12173110. doi:10.1086/341922. Consultado el 5 de diciembre de 2016. 
  7. Heller, Loree C.; Jones, Michael; Widen, Ray H. (1 de junio de 2008). «Comparison of DNA pyrosequencing with alternative methods for identification of mycobacteria». Journal of Clinical Microbiology 46 (6): 2092-2094. ISSN 1098-660X. PMC 2446853. PMID 18417659. doi:10.1128/JCM.02001-07. Consultado el 5 de diciembre de 2016. 
  8. Girault, S.; Chassaing, G.; Blais, J. C.; Brunot, A.; Bolbach, G. (1 de julio de 1996). «Coupling of MALDI-TOF Mass Analysis to the Separation of Biotinylated Peptides by Magnetic Streptavidin Beads». Analytical Chemistry 68 (13): 2122-2126. ISSN 0003-2700. doi:10.1021/ac960043r. Consultado el 5 de diciembre de 2016. 
  9. Meng, Qiutao; Ge, Siqi; Yan, Wenhua; Li, Ruisheng; Dou, Jingtao; Wang, Haibing; Wang, Baoan; Ma, Qingwei et al. (8 de noviembre de 2016). «Screening for potential serum-based proteomic biomarkers for human type 2 diabetes mellitus using MALDI-TOF MS». Proteomics. Clinical Applications. ISSN 1862-8354. PMID 27863080. doi:10.1002/prca.201600079. Consultado el 5 de diciembre de 2016. 
  10. Liang, X.; Zheng, K.; Qian, M. G.; Lubman, D. M. (1 de enero de 1996). «Determination of bacterial protein profiles by matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry with high-performance liquid chromatography». Rapid communications in mass spectrometry: RCM 10 (10): 1219-1226. ISSN 0951-4198. PMID 8759331. doi:10.1002/(SICI)1097-0231(19960731)10:103.0.CO;2-R. Consultado el 5 de diciembre de 2016. 
  11. Emonet, S.; Shah, H. N.; Cherkaoui, A.; Schrenzel, J. (1 de noviembre de 2010). «Application and use of various mass spectrometry methods in clinical microbiology». Clinical Microbiology and Infection (en inglés) 16 (11): 1604-1613. ISSN 1469-0691. doi:10.1111/j.1469-0691.2010.03368.x. Consultado el 5 de diciembre de 2016. 
  12. Beavis, R. C.; Chait, B. T. (1 de diciembre de 1989). «Cinnamic acid derivatives as matrices for ultraviolet laser desorption mass spectrometry of proteins». Rapid communications in mass spectrometry: RCM 3 (12): 432-435. ISSN 0951-4198. PMID 2520223. doi:10.1002/rcm.1290031207. Consultado el 5 de diciembre de 2016. 
  13. Woo, P. C. Y.; Lau, S. K. P.; Teng, J. L. L.; Tse, H.; Yuen, K.-Y. (1 de octubre de 2008). «Then and now: use of 16S rDNA gene sequencing for bacterial identification and discovery of novel bacteria in clinical microbiology laboratories». Clinical Microbiology and Infection: The Official Publication of the European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases 14 (10): 908-934. ISSN 1469-0691. PMID 18828852. doi:10.1111/j.1469-0691.2008.02070.x. Consultado el 5 de diciembre de 2016. 
  14. Karabıçak, Nilgün; Karatuna, Onur; İlkit, Macit; Akyar, Işın (1 de octubre de 2015). «Evaluation of the Bruker Matrix-Assisted Laser Desorption-Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry (MALDI-TOF MS) System for the Identification of Clinically Important Dermatophyte Species». Mycopathologia 180 (3-4): 165-171. ISSN 1573-0832. PMID 25971934. doi:10.1007/s11046-015-9898-x. Consultado el 5 de diciembre de 2016. 
  15. Erhard, Marcel; Hipler, Uta-Christina; Burmester, Anke; Brakhage, Axel A.; Wöstemeyer, Johannes (1 de abril de 2008). «Identification of dermatophyte species causing onychomycosis and tinea pedis by MALDI-TOF mass spectrometry». Experimental Dermatology 17 (4): 356-361. ISSN 1600-0625. PMID 17979969. doi:10.1111/j.1600-0625.2007.00649.x. Consultado el 5 de diciembre de 2016. 
  16. Meng, Qiutao; Ge, Siqi; Yan, Wenhua; Li, Ruisheng; Dou, Jingtao; Wang, Haibing; Wang, Baoan; Ma, Qingwei et al. (1 de noviembre de 2016). «Screening for potential serum-based proteomic biomarkers for human type 2 diabetes mellitus using MALDI-TOF MS». PROTEOMICS – Clinical Applications (en inglés): n/a-n/a. ISSN 1862-8354. doi:10.1002/prca.201600079. Consultado el 13 de diciembre de 2016. 

Véase también

  •   Datos: Q1792222

Agosto 15, 2022
maldi, denomina, maldi, siglas, inglés, matrix, assisted, laser, desorption, ionization, desorción, ionización, láser, asistida, matriz, detector, iones, acopla, maldi, cuyo, nombre, procede, también, siglas, inglés, time, flight, figura, espectrómetro, masas,. Se denomina MALDI por sus siglas en ingles Matrix Assisted Laser Desorption Ionization desorcion ionizacion laser asistida por matriz y TOF por el detector de iones que se acopla al MALDI y cuyo nombre procede tambien de sus siglas en ingles Time Of Flight 1 2 Figura 1 Espectrometro de masas MALDI TOF Tecnica desarrollada en 1987 por el ingeniero japones Koichi Tanaka 3 Consiste en una ionizacion suave del analito que provoca la vaporizacion de intactas moleculas termolabiles no volatiles tales como proteinas y lipidos en un rango de peso molecular entre 2 a 20 kDa a un relativo bajo costo y resultado inmediato 4 5 Muy utilizada para obtener mediante espectrometria de masas un espectro propio de un organismo y comparandolo con bases de datos identificar a nivel de genero especie e incluso cepa aislados bacterianos y fungicos Tambien es posible identificar virus 1 5 Indice 1 Antecedentes 2 Mecanismos y componentes de la espectrometria de masas MALDI TOF MALDI TOF MS 3 Aplicaciones 3 1 Identificacion microbiana y virica 3 2 Busqueda de biomarcadores para el diagnostico de enfermedades 4 Perspectivas 5 Referencias 6 Vease tambienAntecedentes EditarDesde su creacion la espectrometria de masas MS fue un metodo altamente complejo y relegado por varias decadas al analisis de perfiles proteicos en laboratorios de hematologia y quimica En 1975 Anhalt amp Fenselau Anhalt amp Fenselau 1975 usaron extractos bacterianos de distinto genero y especie para obtener espectros de masa unicos y de esta manera identificar por primera vez microorganismos usando MS Cinco anos mas tarde se empezaron las tecnicas de desorcion ionizacion que abarcaban la desorcion por plasma desorcion por laser y bombardeo atomico rapido que ionizan analitos biomoleculares con lo cual los estudios se dirigieron a obtener perfiles bacterianos aunque el aquel tiempo se limitaba al uso de moleculas de bajo peso molecular 6 7 El problema con los espectros obtenidos al aplicar luz laser a las muestras era que el espectro obtenido era de muy baja intensidad luego se descubrio que cuando el analito era mezclado con una matriz organica la luz laser era absorbida mas eficientemente y consecuentemente se obtenian espectros de mayor intensidad Comenzo entonces la epoca de las tecnicas basadas en ionizacion suave tales como la Desorcion ionizacion por laser asistida en matriz MALDI y Ionizacion por electrospray ESI que permitieron via MS obtener perfiles proteicos en un rango de peso molecular bastante amplio asi como de moleculas sin fragmentacion 6 El analizador que mas comunmente se acopla a la fuente MALDI es el analizador de tiempo de vuelo TOF con lo cual nace el nombre de MALDI TOF Holland y colaboradores 1996 mostraron que era posible obtener huellas espectrales MALDI TOF usando como analitos celulas bacterianas enteras sin tratamiento previo a la espectrometria de masas Mas tarde se reportaria que es posible obtener perfiles proteicos usando MALDI TOF a partir de una purificacion posterior a una extraccion celular 8 9 10 Desde la ultima decada del siglo XX se ha incrementado notablemente el numero de publicaciones que emplean MALDI TOF como herramienta de identificacion fungica virica y bacteriana donde se ha llegado incluso a nivel de cepa porque relativamente no es costosa y bastante rapida Mecanismos y componentes de la espectrometria de masas MALDI TOF MALDI TOF MS EditarDe manera general el metodo de ionizacion a ser utilizado depende de la naturaleza de la muestra mezclas simples complejas proteinas lipidos polisacaridos entre otros y del objetivo que busque el estudio identificacion de microorganismos identificacion de proteinas cuantificacion y biotyping o biotipaje MALDI TOF junto con ESI ofrecen una ionizacion suave que mantiene intacto el analito desde la ionizacion hasta su conversion a fase gaseosa 11 Para llevar a cabo el analisis sobre una placa metalica conductora se mezcla la muestra con una matriz organica para lograr una cocristalizacion muestra matriz En alto vacio es tratada con pulsos de luz laser provocando que la matriz absorba esta energia y la convierta en energia de excitacion y transferencia de iones al analito El area tratada se calienta y se provoca la desorcion de iones de fase solida a gaseosa 12 Segun Croxatto Prod hom amp Greub 2012 un espectrometro de masas se divide en tres unidades funcionales 1 Figura 2 Una fuente para ionizar la muestra y transferirla a fase gaseosa Un analizador de masas comunmente se utiliza el analizador TOF time of flight que mide muy precisamente el tiempo de vuelo de los iones desde que son acelerados por la fuente hasta que impactan el detector Un dispositivo de deteccion de los iones separados Figura 2 Espectrometria de masas MALDI TOF Luego de que el analito y la matriz cocristalizan se ingresa la placa metalica al espectrometro de masas donde es bombardeada por pulsos de luz laser para producir la desorcion e ionizacion de las moleculas que son aceleradas por medio de un campo electrostatico En el analizador TOF los iones mas pequenos viajan mas rapidamente que los iones mas grandes El detector recepta los iones y como resultado se produce un espectro especifico para cada analito que se compara con una base de datos parja la identificacion de genero especie o cea Imagen modificada de Croxatto et al 2012 Aplicaciones EditarIdentificacion microbiana y virica Editar Historicamente la confirmacion de la identificacion de microorganismos ha seguido fundamentada en ensayos jerarquicamente dependientes 1 aislamiento pruebas basadas en tinciones y morfologia microscopica 2 cultivos en medio solido o liquido para propagar el organismo de interes 3 pruebas bioquimicas y antigenicas dirigidas al fenotipo y metabolismo microbiano y con el apoyo de manuales bacteriologicos llegar a la identificacion y 4 principalmente cuando la identificacion tiene una aplicacion clinica se prueba susceptibilidad a antibioticos para optar por el mejor tratamiento Lamentablemente los resultados dependen de la tasa de crecimiento del microorganismo por lo que pueden llegar a tardar semanas 1 Anos despues se establecieron tecnicas moleculares basadas en la secuenciacion de barcodes 16S para bacterias y 18S para hongos no obstante es bien conocido que en este tipo de tecnicas es necesaria instrumentacion especializada y una zona del laboratorio especifica Para la mayoria de laboratorios no es rentable tener una zona dedicada a la secuenciacion por tanto la identificacion basada en analisis fenotipico de los microorganismos e g MALDI TOF se perfila como la preferida a la hora de identificacion rutinaria 1 13 La identificacion bacteriana usando MALDI TOF no ha presentado mayor inconveniente salvo algunas especies Los dermatofitos son hongos que crecen en superficies queratinizadas como en el cabello piel y unas Debido a su compleja estructura filamentosa no ha sido sencilla su identificacion por MALDI TOF De entre diez estudios focalizados a la identificacion de dermatofitos usando MALDI TOF Karabicak et al 2015 reportaron el resultado mas bajo 13 5 mientras que Erhard et al 2008 obtuvieron un 99 9 14 15 Luego de analizar minuciosamente estos resultados L Ollivier amp Ranque 2016 concluyeron que los pasos criticos son i la extraccion de proteinas para la cual es necesario hacerlo por el metodo del acido formico acetonitrilo y ii una base de datos confiable 5 Busqueda de biomarcadores para el diagnostico de enfermedades Editar Las herramientas de diagnostico de diabetes mellitus tipo 2 incluyen la prueba de tolerancia a glucosa OGTT glucosa en sangre FBG y hemoglobina glicosilada HbA1c Meng et al 2016 tomaron en cuenta que estas pruebas proveen marcadores retrospectivos y por tanto no podian ser aplicados como predictivos y reportaron la caracterizacion usando MALDI TOF de 6 peptidos peaks m z 1452 9 1692 8 1946 0 2115 1 2211 0 y 4053 6 como potenciales biomarcadores para el diagnostico de la diabetes mellitus tipo 2 Posteriormente realizaron un modelo diagnostico basado en analisis de regresion logistica y curva ROC obteniendo una precision de 82 2 sensibilidad de 82 5 y especificidad de 77 8 16 Perspectivas EditarLos laboratorios de investigacion optan muy preferentemente por la secuenciacion de barcodes como herramienta para la identificacion microbiana sin embargo la implementacion de la espectrometria de masas MALDI TOF y el crecimiento exponencial de las bases de datos permitiran a los laboratorios clinicos una identificacion microbiana muy rapida y a bajo costo Tomando en cuenta la crisis que se avecina por el abuso de antibioticos estas ventajas son aspectos claves para un pronto tratamiento a los pacientes En el futuro los espectrometros de masa estaran automatizados para llevar a cabo un test antibiotico y por lo tanto una parcial o completa caracterizacion microbiana que en la actualidad podria tomar varios dias como se menciono anteriormente A mediano plazo podria no ser necesario el cultivo de los microorganismos en medio para algunos casos 2 Referencias Editar a b c d e Croxatto Antony Prod hom Guy Greub Gilbert 1 de marzo de 2012 Applications of MALDI TOF mass spectrometry in clinical diagnostic microbiology FEMS Microbiology Reviews en ingles 36 2 380 407 ISSN 1574 6976 doi 10 1111 j 1574 6976 2011 00298 x Consultado el 5 de diciembre de 2016 a b Clark Andrew E Kaleta Erin J Arora Amit Wolk Donna M 1 de julio de 2013 Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Time of Flight Mass Spectrometry a Fundamental Shift in the Routine Practice of Clinical Microbiology Clinical Microbiology Reviews en ingles 26 3 547 603 ISSN 0893 8512 PMC 3719498 PMID 23824373 doi 10 1128 CMR 00072 12 Consultado el 5 de diciembre de 2016 The 2002 Nobel Prize in Chemistry Popular Information www nobelprize org Consultado el 5 de diciembre de 2016 Karas M Bachmann D Bahr U Hillenkamp F 24 de septiembre de 1987 Matrix assisted ultraviolet laser desorption of non volatile compounds International Journal 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