Cromatografía
La cromatografía es un método físico de separación para la caracterización de mezclas complejas cuyo objetivo es separar los distintos componentes, la cual tiene aplicación en todas las ramas de la ciencia; en el principio de retención selectiva, cuyo objetivo es separar los distintos componentes de una mezcla, permitiendo identificar y determinar las cantidades de dichos componentes. Diferencias sutiles en el coeficiente de partición de los compuestos dan como resultado una retención diferencial sobre la fase estacionaria y, por tanto, una separación efectiva en función de los tiempos de retención de cada componente de la mezcla.
La cromatografía puede cumplir dos funciones básicas que se excluyen mutuamente:
- Separar los componentes de la mezcla, para obtenerlos más puros y que puedan ser usados posteriormente (etapa final de muchas síntesis).
- Medir la proporción de los componentes de la mezcla (finalidad analítica). En este caso, las cantidades de material empleadas suelen ser muy pequeñas.
Historia
La cromatografía, (proviene del griego χρῶμα chrōma y γράφω gráphō, que significan respectivamente "color" y "escribir, registrar", literalmente "escritura de color", o "registro de color") , fue empleada originalmente con sustancias coloreadas.
Ya en 1850, Runge describió la formación de zonas coloreadas cuando se depositaban gotas de sustancias colorantes sobre papel secante, pero el desarrollo más importante vino con los experimentos de Mijaíl Tsvet[1] (1872-1919), que empleó por primera vez en 1906 el término "cromatografía". A comienzos del año 1903, Mijaíl Tsvet, botánico ruso, logró separar una mezcla de pigmentos de plantas (clorofilas) en una columna de carbonato de calcio. Más tarde, en 1910, cromatografió un extracto de yema de huevo en una columna de inulina. Sus investigaciones, sin embargo, no fueron utilizadas por otros investigadores hasta 1931. Esta demora quizá se debió al hecho de que los trabajos de Tsvet fueron publicados en ruso y en una revista que no tenía amplia circulación.
El rápido desarrollo de la cromatografía como herramienta analítica sensible no ocurrió hasta 1931, cuando Kuhn, con Lederer y con Winterstein, emplearon la técnica para el análisis de pigmentos de plantas, confirmando los primeros trabajos de Tsvet y su predicción de que el caroteno no era una sola sustancia, sino una mezcla de varios homólogos estrechamente relacionados. Al mismo tiempo, el tamaño de las columnas empleadas fue aumentando para poder recuperar los componentes separados. La técnica, por lo tanto, no era solo analítica sino preparatoria.
Por aquel entonces la cromatografía en columna tenía aplicaciones limitadas, dado que los componentes que se podían separar eran invariablemente lípidos. Pasaron 10 años antes de que Martin y Synge desarrollaran una técnica mediante la cual se pudieran separar compuestos acuosos o hidrofílicos. Esto marcó un nuevo interés en la técnica y en 1944 Consden, Gordon y Martin lograron separar mezclas complejas de aminoácidos en papel y fueron premiados con el Premio Nobel por sus trabajos. Al poco tiempo, en 1947, en Estados Unidos, la Comisión de Energía Atómica dio a conocer información sobre el uso de la cromatografía de intercambio iónico para la separación de productos de fisión nuclear.
El desarrollo más reciente en el campo de la cromatografía se deriva de los trabajos de Stahl, quien en 1956 presentó una técnica práctica mediante la que una capa delgada sílice gel, celulosa o alúmina era diseminada sobre una placa de vidrio. Esta técnica, llamada cromatografía de capa fina, resultó en un análisis más rápido y más sensible para el examen de mezclas complejas y, en muchos casos, ha sustituido a otros métodos similares más antiguos de cromatografía en papel toche.
En 1959, Porath y Flodin introdujeron una nueva técnica llamada cromatografía de filtración de gel. Esta se ha convertido en una nueva y poderosa herramienta para la separación de sustancias de alto peso molecular, particularmente las proteínas, y ha encontrado muchas aplicaciones en los campos de la bioquímica, la medicina, la fisiología y la biología. La mayoría de las técnicas de filtración en gel utilizan columnas y recientemente se han hecho trabajos con una combinación de filtración en gel y materiales de intercambio iónico, logrando que las separaciones complejas sean extremadamente rápidas y eficientes.
Los primeros equipos de cromatografía de gases aparecieron en el mercado a mediados del siglo XX. A su vez, la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC High Performance Liquid Chromatography, en inglés) comenzó a desarrollarse en los años 1960, aumentando su importancia en las décadas siguientes, hasta convertirse en la técnica cromatográfica más empleada. Sin embargo esto se irá modificando con el paso de los años.
Clasificación de los métodos de separación en cromatografía
Las distintas técnicas cromatográficas[2] pueden dividirse según cómo esté dispuesta la fase estacionaria:
- Cromatografía plana. La fase estacionaria se sitúa sobre una placa plana o sobre un papel. Las principales técnicas son:
- Cromatografía en columna. La fase estacionaria se sitúa dentro de una columna. Según el fluido empleado como fase móvil se distinguen:
La cromatografía de gases se aplica a numerosos compuestos orgánicos. En el caso de compuestos no volátiles, se recurre a procesos denominados de "derivatización", a fin de convertirlos en otros compuestos que se volatilicen en las condiciones de análisis.
Dentro de la cromatografía líquida, destaca la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC, del inglés High Performance Liquid Chromatography), que es la técnica cromatográfica más empleada en la actualidad, normalmente en su modalidad de fase reversa, en la que la fase estacionaria tiene carácter no polar, y la fase móvil posee carácter polar (generalmente agua o mezclas con elevada proporción de la misma o de otros disolvente polares, como por ejemplo, metanol). El nombre de "reversa" viene dado porque tradicionalmente la fase estacionaria estaba compuesta de sílice o alúmina, de carácter polar, y por tanto la fase móvil era un disolvente orgánico poco polar. Una serie eluotrópica es un rango de sustancias de diferentes polaridades que actúan como fase móvil y que permiten observar un mejor desplazamiento sobre una fase estacionaria.
| Tipos | Fase móvil | Fase estacionaria |
| Cromatografía en papel | Líquido | Papel de celulosa. |
| Cromatografía en capa fina | Líquido | Gel de sílice o alúmina. |
| Cromatografía de gases | Gas | Columnas capilares de sílice fundida, con recubrimientos internos de varios tipos de siloxanos enlazados, columnas empaquetadas con tierras diatomeas hechas de tubos de vidrio o metal. |
| Cromatografía líquida en fase reversa | Líquido (polar) | Relleno de siloxano de octilo o siloxano de octadecilo. |
| Cromatografía líquida en fase normal | Líquido (menos polar) | Relleno de sílice, alúmina o un soporte al que se unen químicamente grupos polares (ciano, amino, etc). |
| Cromatografía líquida de intercambio iónico | Líquido (polar) | Resinas de intercambio iónico. |
| Cromatografía líquida de exclusión | Líquido | Relleno de pequeñas partículas de sílice o polímeros con red de poros uniforme. |
| Cromatografía líquida de adsorción | Líquido | Partículas finamente divididas de sílice o de alúmina. |
| Cromatografía de fluidos supercríticos | Líquido | Columnas abiertas de sílice fundida con recubrimientos internos de varios tipos de siloxanos enlazados y de enlaces cruzados. |
Términos empleados en cromatografía[3]
- Analito es la sustancia que se va a separar durante la cromatografía.
- Fase móvil es la fase que se mueve en una dirección definida. Puede ser un líquido (cromatografía de líquidos o CEC). un gas (cromatografía de gases) o un fluido supercrítico (cromatografía de fluidos supercríticos). La muestra que se está separando/analizando (formada de analito/s y el disolvente) se inyecta en la fase móvil que se mueve a través de la columna. En el caso de la cromatografía líquida de alta resolución, HPLC, la fase móvil es un disolvente no polar como el hexano (fase normal) o bien algún disolvente polar (cromatografía de fase reversa).
- Fase estacionaria es la sustancia que está fija en una posición durante la cromatografía. Un ejemplo es la capa de gel de sílice en la cromatografía en capa fina.
- Cromatografía analítica se emplea para determinar la existencia y posiblemente también la concentración de un analito en una muestra.
- Fase enlazada es una fase estacionaria que se une de forma covalente a las partículas de soporte o a las paredes internas de la columna.
- Cromatograma es el resultado gráfico de la cromatografía. En el caso de separación óptima, los diferentes picos o manchas del cromatograma se corresponden a los componentes de la mezcla separada.
- Cromatograma con picos no resueltos (separados).Cromatograma con dos picos resueltos.
- En el eje X se representa el tiempo de retención, y en el eje Y una señal (obtenida, por ejemplo, a partir de un espectrofotómetro, un espectrómetro de masas o cualquier otro de los diversos detectores) correspondiente a la respuesta creada por los diferentes analitos existentes en la muestra. En el caso de un sistema óptimo, la señal es proporcional a la concentración del analito específico separado.
- Cromatógrafo es el equipo que permite una separación sofisticada. Por ejemplo, un cromatógrafo de gases o un cromatógrafo de líquidos.
- Cromatografía es el método físico de separación en el cual los componentes que se van a separar se distribuyen entre dos fases, una de las cuales es estacionaria (fase estacionaria) mientras la otra (la fase móvil) se mueve en una dirección definida.
- Eluyente es la fase móvil que atraviesa la columna.
- Serie eluotrópica es una lista de disolventes clasificados según su poder de dilución.
- Fase inmovilizada es una fase estacionaria que está inmovilizada sobre partículas de soporte, o en la pared interior del tubo contenedor o columna.
- Cromatografía preparativa se usa para purificar suficiente cantidad de sustancia para un uso posterior, más que para análisis.
- Tiempo de retención es el tiempo característico que tarda un analito particular en pasar a través del sistema (desde la columna de entrada hasta el detector) bajo las condiciones fijadas. Véase también: Índice de retención de Kovats
- Muestra es la materia que va a ser analizada en la cromatografía. Puede consistir en un simple componente o una mezcla de varios. Cuando la mezcla es tratada en el curso del análisis, la fase o fases que contienen los analitos de interés es llamada igualmente muestra mientras el resto de sustancias cuya separación no resulta de interés es llamada residuo.
- Soluto es cada uno de los componentes de la muestra que va a ser separado.
- Disolvente es toda sustancia capaz de solubilizar a otra,y especialmente la fase móvil líquida en cromatografía de líquidos.
- Capacidad de carga Es la cantidad máxima de muestra que puede ser separada en una sola carga.
- Capacidad de fraccionamiento Es el número máximo de componentes que pueden ser separados en una sola operación.
- Selectividad Es la capacidad de poder discriminar y distinguir entre dos componentes.
Véase también
- Wikimedia Commons alberga una categoría multimedia sobre Cromatografía.
- Proceso de separación
- Serie eluotrópica
- Cromatografía de gases
- Cromatografía en capa fina
- Cromatografía de inmunoafinidad
Referencias
- La cromatografía. Fundamentos de tecnología de productos fitoterapéuticos. Nikolai Sharapin. Editorial Convenio Andrés Bello, 2000. ISBN 9586980014. Pág. 159-190.l
- Técnicas de bioquímica y biología molecular. Jorge David Roriguez Miranda. Editorial Reverté, 1991. ISBN 8429118195. Cap. 8: Cromatografía. Pág. 179
- Glosario de los términos más usados en cromatografía. Introducción a la Cromatagrafía. Stella Torres de Young. Ediciones de la Univ. Nacional de Colombia. ISBN 9581701192. Pág. 15
Enlaces externos
- Universidad de Granada.
- Separaciones por cromatografía. Universidad de Las Palmas de Gran Canaria.