fbpx
Wikipedia

CRISPR

Enero 26, 2022

Los CRISPR (en inglés clustered regularly interspaced short palindromic repeats, en español repeticiones palindrómicas cortas agrupadas y regularmente interespaciadas[2]​) son familias de secuencias de ADN en bacterias. Las secuencias contienen fragmentos de ADN de virus que han atacado a las bacterias. Estos fragmentos son utilizados por la bacteria para detectar y destruir el ADN de nuevos ataques de virus similares, y así poder defenderse eficazmente de ellos. Estas secuencias juegan un papel clave en los sistemas de defensa bacterianos, y forman la base de una tecnología conocida como CRISPR / Cas9 que efectiva y específicamente cambia los genes dentro de los organismos. En términos más técnicos son loci de ADN que contienen repeticiones cortas de secuencias de bases. Tras cada repetición siguen segmentos cortos de "ADN espaciador" proveniente de exposiciones previas a un virus.[3]​ Se encuentran en aproximadamente el 40% de los genomas bacterianos y en el 90% de los genomas secuenciados de las arqueas.[4]​[5]​ Con frecuencia se hallan asociados con los genes cas, que codifican para proteínas nucleasas relacionadas con los CRISPR. El sistema CRISPR/Cas es un sistema inmunitario procariótico que confiere resistencia a agentes externos como plásmidos y fagos[6]​[7]​ y provee una forma de inmunidad adquirida. Los espaciadores de los CRISPR reconocen secuencias específicas y guían a las nucleasas cas para cortar y degradar esos elementos génicos exógenos de una manera análoga al ARNi en sistemas eucarióticos.[3]​

CRISPR
CRISPR + fragmentos de ADN de E.Coli.
Identificadores
Organismo E.Coli
Símbolo ?
Otros datos


Diagrama del posible mecanismo de los CRISPR.[1]​

Desde 2013 el sistema CRISPR/Cas se ha utilizado para la edición de genes (agregando, interrumpiendo o cambiando las secuencias de genes específicos) y para la regulación génica en varias especies.[8]​ Al administrar la proteína Cas9 y los ARN guía apropiados a una célula, el genoma de esta puede cortarse en los lugares deseados, cuyas secuencias serán complementarias a las de los ARN guía utilizados. Esto permite la eliminación funcional de genes o la introducción de mutaciones (tras la reparación del corte realizado por la maquinaria celular de reparación del ADN) para estudiar sus efectos. Modificaciones recientes del sistema CRISPR/Cas9 permiten también actuar sobre la transcripción de los genes, modificando así solo su nivel de funcionamiento, pero no la información genética.

Quizá puedan usarse los CRISPRs para construir sistemas de entrega de genes guiados por ARN que lleguen a alterar los genomas de poblaciones enteras.[9]​

Antecedentes

Las bacterias pueden incorporar ADN externo en otras circunstancias e incluso pueden tomar ADN dañado de su medio.[10]​

Las secuencias repetidas que luego se conocerían como CRISPR fueron identificadas por primera vez por un grupo de científicos japoneses en 1987 (Yoshizumi Ishino et al).[11]​[12]​y luego más tarde de forma independiente por el científico Francisco J. M. Mojica (Universidad de Alicante) a principios de los años 90 en una arquea Haloferax mediterranei y los resultados fueron publicados en 1993,[13]​ tras haber sido anteriormente descritas en bacterias (Escherichia coli[12]​ y Mycobacterium bovis[14]​). Inicialmente fueron utilizadas para el tipado de bacterias, para diferenciar distintos aislados, cepas y especies.[15]​ Estudios iniciales por Francisco J. M. Mojica y colaboradores postularon el posible papel de estas secuencias en la partición de replicones.[16]​ En el año 2000, Francisco J. M. Mojica y colaboradores detectaron un gran número de estas secuencias repetidas en bacterias, arqueas y mitocondrias y propusieron el nombre de Short Regularly Spaced Repeats (SRSR, en castellano "Repeticiones Cortas Regularmente Espaciadas".[17]​ Pocos años después, Francisco J. M. Mojica propuso y acuñó el acrónimo CRISPR (del inglés: Clustered Regularly Interspaced Short Palyndromic Repeats), propuesta que quedó recogida en una publicación de microbiólogos holandeses en 2002[18]​ y que sería utilizada universalmente desde entonces para referirse a estas secuencias. También, en la misma publicación, se describió por vez primera un conjunto de genes, algunos de los cuales codifican nucleasas o helicasas putativas, asociados a las secuencias repetidas CRISPR (los genes cas o asociados a CRISPR: del inglés: CRISPR associated).[18]​

 
Diagrama simplificado de un locus CRISPR, donde se muestran sus tres componentes mayoritarios: los genes cas, una secuencia líder y un arreglo de repeticiones-espaciadores. las repeticiones se muestran como cajas grises y los espaciadores son las barras de color. El arreglo de esos tres componentes no siempre es como se muestra.[1]​[3]​ Además, en el mismo genoma pueden presentarse varios CRISPRs con un DR similar, de los cuales solo uno esté asociado con los genes cas.[5]​

En 2005, tres grupos de investigación independientes mostraron que algunos de los espaciadores de los CRISPRs se derivan de diversas fuentes de ADN como ADN de fagos y ADN extracromosomal como los plásmidos.[19]​[20]​ Nuevamente fue el grupo de Francisco J. Mojica quien primero se dio cuenta de que las secuencias CRISPR y los espaciadores asociados podían formar parte de algún sistema inmune propio de estos microorganismos procarióticos, quien primero estableció la relación entre CRISPR e inmunidad.[21]​ Esas observaciones clave indican que el sistema CRISPR/cas puede tener un rol en la inmunidad adaptativa en las bacterias.[1]​ Koonin y sus asociados[22]​ propusieron que los espaciadores sirven como plantilla para moléculas de ARN, análogo a un sistema que usan los eucariontes llamado interferencia por ARN.

En 2007 Barrangou, Horvath (científicos de la industria alimenticia en Danisco) y el grupo de Moineau en la Université Laval (Canadá) mostraron que podían alterar la resistencia de Streptococcus thermophilus a ataques de fagos con ADN espaciador.[22]​

Cas9

Jennifer Doudna y Emmanuelle Charpentier, ganadoras del Premio Nobel de Química 2020, junto con Francisco Juan Martínez Mojica, habían estado explorando de manera independiente a las proteínas asociadas a CRISPR para aprender cómo las bacterias utilizan a los espaciadores en sus sistemas inmunes. Juntas estudiaron un sistema CRISPR más simple que se basa en una proteína llamada Cas9. Encontraron que las bacterias responden ante un fago invasor al transcribir espaciadores y ADN palindrómico en una larga molécula de ARN y que entonces la célula utilizaba un ARN llamado Trans-activating crRNA (tracrRNA) y también Cas9 para cortarla en pedazos llamados ARNcr.[22]​

Cas9 es una nucleasa, una enzima especializada en cortar ADN, con dos sitios de corte activos (HNH y RuvC), uno para cada hebra de la doble hélice. El equipo demostró que podrían desactivar uno o ambos sitios preservando la habilidad de Cas9 de ser específico para su ADN objetivo. Jinek combinó al tracrRNA y ARN espaciador para formar una molécula llamada single-guide RNA que, al combinarse con Cas9, podía encontrar y cortar los blancos correctos de ADN. Jinek propuso que estos ARN guía sintéticos podrían usarse para la edición de genes.[22]​

La primera vez que se mostró que CRISPR funcionaba como una herramienta de ingeniería genética en cultivos de células humanas fue en 2012.[23]​[24]​ Desde entonces se ha utilizado en muchos organismos, incluida la levadura del pan (Saccharomyces cerevisiae),[25]​ el pez cebra (Danio rerio),[26]​ la mosca de la fruta (Drosophila melanogaster),[27]​ nematodos (Caenorhabditis elegans)[28]​ plantas[29]​ y ratones,[30]​ entre otros.

Adicionalmente, CRISPR ha sido modificada para hacer factores de transcripción programables que permiten a los científicos silenciar o activar ciertos genes.[31]​

Existen ahora librerías con decenas de miles de ARN guía.[22]​

La primera evidencia de que CRISPR puede revertir síntomas de enfermedad en organismos vivos fue demostrada en marzo de 2014, cuando investigadores del MIT curaron a ratones de desórdenes genéticos del hígado.[32]​

Cas12a (anteriormente Cpf1)

En 2015, la nucleasa Cpf1 se descubrió en el sistema CRISPR/Cpf1 de la bacteria Francisella novicida.[33]​[34]​ Cpf1 mostró varias diferencias claves de Cas9 incluyendo: causando un corte 'escalonado' en el ADN de doble hebra, en oposición al corte 'brusco' producido por Cas9, basándose en un PAM rico en T (proporcionando sitios de orientación alternativos a Cas9) y requiriendo solamente Un CRISPR ARN (CRRNA) para el éxito de la orientación. Por el contrario Cas9 requiere tanto crARN y un crARN trans activado (tracrRNA)).

Actualmente esta nucleasa recibe el nombre de Cas12a, y presenta algunas variantes en función del organismo de origen, entre las que se encuentran AsCas12a (presente en la bacteria Acidaminococcus), y LbCas12a (presente en Lachnospiraceae bacterium). Además, en esta última variante se descubrió una mutación puntual, D156R, que representa la sustitución del aminoácido ácido aspártico por arginina en la posición 156 de la proteína. Cas12aD156R muestra un aumento en la eficiencia de corte en el modelo vegetal Arabidopsis thaliana, similar al que después se corroboró en D. melanogaster, generando una eficiencia en la tasa de edición génica próxima a la observada en Cas9.[35]​

CasΦ

Se trata de una nucleasa hipercompacta descrita en 2020 que representa la mitad del peso molecular de Cas9/Cas12 y con características similares en su utilización como herramienta para la edición génica.[36]​ Además, se ha adaptado de forma exitosa a la edición in vivo en Drosophila melanogaster de forma precisa sin generar cortes en el ADN de doble cadena.[37]​

Predecesores para edición génica

Al inicio de la década de los 2000, investigadores desarrollaron las nucleasas con dedos de zinc, proteínas sintéticas cuyas regiones de unión a ADN les permitían cortar el ADN en puntos específicos. Después, las nucleasas sintéticas llamadas TALENs dieron una vía más sencilla para llegar a ADN específico y se predijo que sobrepasarían a las de los dedos de zinc. Ambas dependen de la elaboración de proteínas específicas para cada ADN objetivo, un procedimiento bastante más complicado que los ARN guía. Los CRISPRs son más eficientes y pueden llegar a más genes que ambas técnicas.[38]​

Primera edición génica comunicada en julio de 2017

El 12 de julio de 2017 la revista británica Nature comunicó un trabajo recibido el 22 de agosto de 2016, comunicando que investigadores de la Universidad de Harvard modificaron en el genoma de un grupo de bacterias, por medio de corta-pega o copipasteo genético logrado con la técnica CRISPR, la información digital de una fotografía y un GIF o animación corta. Después secuenciaron el ADN de los microorganismos para recuperar la imagen y el video con una precisión del 90%.[39]​ El avance atrajo nuevo interés científico en el campo de la ‘grabación molecular’ y en particular conjeturas, al parecer prematuras e inexactas, sobre la memorización en sistemas accedidos desde un psiquismo.

Estructura del locus

Repeticiones y espaciadores

Los loci de CRISPR van de 24 a 48 pares de bases.[40]​ Las repeticiones están separadas por espaciadores de longitud similar.[40]​ Algunas secuencias espaciadoras de CRISPR son complementarias a las de los plásmidos y fagos,[19]​[21]​[20]​ aunque algunos espaciadores se complementan con el genoma procarionte (espaciadores autoreplicativos).[19]​[41]​ Pueden añadirse rápidamente espaciadores nuevos como respuesta a una infección por un fago.[42]​

Genes cas y subtipos de CRISPR

Los genes asociados a CRISPR, llamados cas, son genes frecuentemente relacionados con los arreglos de repeticiones CRISPR. Análisis extensivos de genómica comparativa han identificado a muchos genes cas diferentes; un análisis inicial de 40 genomas de bacterias y arqueas sugirió que podría haber 45 familias de genes cas, con solo dos genes, cas1 y cas2, siendo omnipresentes.[40]​ El sistema actual de clasificación de CRISPR agrupa a los operones en cas en tres grupos mayores, cada uno con múltiples subdivisiones basadas en filogenia de cas1 y en el complemento del operón del gen cas.[43]​ Aparte de cas1 y cas2, las tres divisiones mayores tienen conjuntos muy diferentes de genes constitutivos, con cada una de las divisiones conteniendo un ‘gen característico’ encontrado exclusivamente en esa subdivisión. Muchos organismos contienen múltiples sistemas CRISPR-Cas sugiriendo que son compatibles e incluso podrían compartir elementos.[44]​ La distribución esporádica de los subtipos de CRISPR/Cas sugiere que el sistema está sujeto a la transferencia genética horizontal durante la evolución microbiana.

Genes característicos y sus funciones putativas para los tipos mayores y menores de CRISPR-Cas
Tipo Cas Gen característico Función Referencia
I Cas3 Nucleasa para ADN de cadena sencilla. Helicasa dependiente de ATP [45]​
IA Cas8a Subunidad del módulo de interferencia [46]​
IB Cas8b
IC Cas8c
ID Cas10d Contiene un dominio homólogo al dominio de las polimerasas de ácidos nucleicos y ciclasas de nucleótidos [43]​[47]​
IE Cse1
IF Csy1 Indeterminado
II Cas9 Las nucleasas RuvC and HNH, juntas, producen cortes en cadena doble, y de manera separada pueden producir cortes en cadena sencilla [48]​
IIA Csn2 Indeterminado
IIB Cas4 Indeterminado
IIC Caracterizado por la ausencia ya sea de Csn2 o Cas4 [49]​
III Cas10 Homólogo de Cas10d y Cse1 [47]​
IIIA Csm2 Indeterminado
IIIB Cmr5 Indeterminado

Mecanismo

 
Las etapas de inmunidad CRISPR por cada uno de los tres tipos mayores de inmunidad adaptativa. (1) Comienza la adquisición por el reconocimiento de ADN invasor por Cas1 and Cas2 y hay corte de un protoespaciador. (2) El protoespaciador se liga a repetidos directos adyacentes a la secuencia líder y (3) la extensión de cadena sencilla repara el CRISPR y duplica el repetido directo. El procesado e interferencia de ARNcr ocurren diferentemente en cada uno de los tres sistemas mayores de CRISPR. (4) El transcrito primario de CRISPR es cortado por los genes cas para producir ARNcr. (5) En sistemas tipo I, Cas6e/Cas6f cortan en la unión de ARN de cadena sencilla y ARN de cadena doble formada por vueltas tipo "hairpin" en el repetido directo. Los sistemas tipo II usan un ARN trans-activador (tracr) para formar ARN de cadena doble, el cual es cortado por Cas9 y la RNasaIII. Los sistemas tipo II usan un homólogo de Cas 6 que no requiere vueltas tipo hairpin en los repetidos directos para efectuar el corte. (6) En los sistema II y III, se hace un recorte secundario ya sea en el extremo 5’ o 3’ para producir ARNcr maduros. (7) Los ARNcr maduros se asocian con las proteínas cas para formar complejos de interferencia. (8) En sistemas tipo I y II, el apareamiento de bases entre el ARNcr y el PAM provoca la degradación del ADN invasor. En el tipo III los sistemas no requieren PAM para la degradación exitosa y en los sistemas tipo III-A el apareamiento de bases ocurre entre ARNcr y ARNm en vez de con ADN, dirigido por los sistemas tipo III-B.

Adquisición de los espaciadores dentro de los loci de los CRISPR

Capturar al ADN invasor e integrarlo en un locus CRISPR en forma de un espaciador es la primera etapa en la respuesta inmune. La prevalencia de cas1 y cas2 fue la primera pista de que estaban involucrados en la adquisición de los espaciadores ya que todos los CRISPRs comparten la estructura repetitiva regular. Estudios de mutaciones confirmaron esta hipótesis ya que al remover cas1 o cas2 impedía la adquisición de espaciadores, sin afectar la respuesta inmune CRISPR en sí.[46]​[50]​[51]​[52]​[53]​ La función exacta de Cas1 y Cas2 se desconoce, sin embargo un número de proteínas Cas1 se han caracterizado bioquímicamente y se han resuelto sus estructuras.[54]​[55]​[56]​ Las proteínas Cas1 tienen secuencias de aminoácidos muy diversas, sin embargo sus estructuras cristalinas son sorprendentemente similares y todas las cas1 purificadas son nucleasas dependientes de metales que se unen a ADN en modo independiente de secuencia.[44]​ Las proteínas Cas2 representativas también han sido caracterizadas y poseen actividad específica de endorribonucleasa ya sea para ARN de cadena sencilla o ADN de cadena doble[57]​[58]​[59]​ Los datos funcionales y estudios de mutación genética sugieren que Cas1 y Cas2 cortan fragmentos de ADN invasor y los insertan en arreglos CRISPR.

El análisis bioinformático de regiones de genomas de fagos que fueron cortados como espaciadores (denominados protoespaciadores) reveló que estos no estaban distribuidos aleatoriamente sino más bien se encontraban adyacentes a secuencias cortas de ADN (de 3 a 5 pb) llamadas PAMs (protospacer adjacent motifs en inglés).[60]​ El análisis de los sistemas CRISPR-Cas de las tres divisiones mayores han mostrado que los PAMs son importantes para los sistemas tipo I y II, pero no para el III durante el proceso de adquisición de espaciadores.[20]​[61]​[62]​[60]​[63]​[64]​ En sistemas tipo I y II, los protoespaciadores se cortan en posiciones adyacentes a una secuencia PAM, con el otro extremo del espaciador siendo cortado con un mecanismo tipo regla inherente a la proteína Cas1, manteniendo así la regularidad en tamaño de los espaciadores a lo largo del arreglo de CRISPR.[65]​[66]​ La conservación de la secuencia PAM difiere entre los sistemas CRISPR-Cas y parece estar ligada evolutivamente a cas1 y a la secuencia líder.[64]​[67]​

Los nuevos espaciadores se añaden a un arreglo de CRISPR en un modo direccional,[19]​ ocurriendo preferencialmente[61]​[62]​[68]​[42]​[69]​ pero no exclusivamente, en forma adyacente[63]​[66]​ a la secuencia líder. El análisis del sistema tipo I-E de E. coli ha demostrado que la primera repetición directa, adyacente a la secuencia líder, es copiado, con el espaciador recientemente adquirido siendo insertado entre la primera y segunda repeticiones directas.[52]​[65]​ La secuencia PAM también parece ser importante durante la inserción de espaciadores den sistemas tipo I-E. La secuencia PAM del sistema I-E contiene un nucleótido final fuertemente conservado (adyacente al primer nucleótido del protoespaciador) y se ha mostrado que este nucleótido se convierte en la base final en la primera repetición directa.[53]​[70]​[71]​ Esto sugiere que la maquinaria de adquisición de espaciadores genera overhangs de cadena sencilla en la penúltima posición de la repetición directay en el PAM durante la inserción del espaciador. Sin embargo no todos los sistemas CRISPR-Cas parecen tener este mecanismo ya que los PAMs caracterizados en otros organismos no muestran el mismo nivel de conservación en la posición final.[67]​ Es probable que en esos sistemas, un extremo romo es generado al final de la repetición directa y el protoespaciador durante la adquisición. Análisis reciente de CRISPRs de Sulfolobus solfataricus han revelado más complejidades al modelo canónico de la inserción de espaciadores ya que uno de sus seis locus insertó espaciadores de manera aleatoria a lo largo de su arreglo CRISPR, opuesto a una inserción más cercana a la secuencia líder.[66]​

Ha sido notado en una cantidad de CRISPRs que estos contienen muchos espaciadores para el mismo fago. El mecanismo que causa este fenómeno ha sido dilucidado recientemente en el sistema tipo I-E de E. coli. Una mejora significativa en la adquisición de espaciadores ha sido detectada donde ya hay espaciadores con el fago como objetivo inclusive con "desajustes" al protoespaciador. Este ‘cebado’ requiere que tanto las proteínas Cas involucradas en adquisición como en interferencia interactúen entre sí. Los espaciadores nuevamente adquiridos que resultan del mecanismo de cebado siempre se encuentran en la misma cadena que la del espaciador original que produjo el cebado.[53]​[70]​[71]​ Esta observación ha llevado a la hipótesis de que la maquinaria de adquisición recorre el ADN extraño después del cebado para encontrar un nuevo protoespaciador.[71]​

Etapa de interferencia

La respuesta inmune por CRISPR ocurre en dos etapas: la biogénesis de CRISPR-ARN (ARNcr) y la interferencia guiada por ARNcr. Un arreglo de CRISPR es transcrito de un promotor en el líder en un solo transcrito largo.[46]​[72]​[73]​ Este transcrito es procesado por cortes dentro de las secuencias repetidas para formar ARNcr. Los mecanismos para producir ARNcr maduros varían de gran manera entre los tres sistemas principales de CRISPR-Cas. Tanto en sistemas del tipo I-E como I-F las proteínas Cas6e y Cas6f respectivamente, reconocen giros[74]​[75]​[76]​ creados por la naturaleza palindrómica de las repeticiones directas.[77]​ Esas proteínas cortan el transcrito primario en la unión entre los ARN de cadena sencilla y doble, dejando un extremo 5ʹ de 8 nucleótidos originado de la repetición en los ARNcr maduros y con una secuencia espaciadora. Los sistemas tipo III también usan Cas6, sin embargo, sus repeticiones no producen girosstem-loops, sino que la escisión ocurre por el "enroscamiento" del transcrito primario a lo largo de la Cas6 para permitir la división justo antes de la secuencia de repetición.[78]​[79]​[80]​ Los sistemas tipo II no poseen el gen Cas6 así que utilizan a la ARNsaIII para hacer los cortes. Los sistemas funcionales tipo II codifican un pequeño ARN adicional que es complementario a la secuencia de las repeticiones conocido como ARN trans-activador(tracrRNA).[50]​ La transcripción del tracrRNA y del transcrito primario CRISPR resulta en emparejamiento de bases y la formación de ARN de doble cadena en la secuencia de repeticiones, la cual es subsecuentemente cortada por la ARNasaIII para producir ARNcr. A diferencia de los otros dos sistemas el ARNcr no contiene el espaciador completo, está truncado en un extremo por diez nucleótidos.[48]​

Los ARNcr se asocian con las proteínas Cas para formar complejos de ribonucleótidos que reconocen ácidos nucleicos extraños. Experimentos con fagos y plásmidos han indicado que los ARNcr no tienen preferencia por cadenas codificantes o no codificantes, lo cual indica un sistema específico para ADN guiado por ARN.[7]​[46]​[53]​[81]​[82]​[83]​[84]​ El complejo tipo I-E (llamado Cascade de forma común) requiere cinco proteínas Cas arregladas en una configuración que recuerda a un caballo de mar, unidas al ARNcr de cadena sencilla que está unido a lo largo del "lomo".[85]​[86]​ Durante el estado de interferencia en los sistemas tipo I la secuencia PAM es reconocida en la cadena complementaria al ARNcr y se requiere junto con el apareamiento de ARNcr. En los sistemas tipo I, el correcto emparejamiento entre el ARNcr y los protoespaciadores señaliza un cambio conformacional en Cascade que recluta a Cas3 para la degradación del ADN.

Los sistemas de tipo II utilizan una proteína multifuncional, Cas9, para el paso de interferencia.[48]​ La Cas9 requiere tanto al ARNcr como al tracrRNA para funcionar y corta al ADN usando sus dominios duales de endonucleasa: HNH y RuvC. El apareamiento de bases entre el PAM y el genoma del fago también se requiere en los sistemas tipo II, sin embargo el PAM es reconocido en la misma cadena que el ARNcr (la cadena opuesta a los sistemas tipo I).

Los sistemas tipo III, como los de tipo I, requieren un complejo multiproteico para asociarse con el ARNcr. Análisis bioquímicos y estructurales de S. solfataricus y Pyrococcus furiosus han dilucidado que seis o siete proteínas cas se unen a los ARNcr, respectivamente.[87]​[88]​ Sorpredentemente, los sistemas tipo III analizados en S. solfataricus y P. furiosus son específicos para el ARNm de fagos y plásmidos,[89]​[88]​ lo cual puede hacer a esos sistemas capaces de ser específicos para genomas de fagos basados en ARN.[44]​ El mecanismo para distinguir ADN propio del externo durante la interferencia está dentro de los ARNcr y por lo tanto se infiere que es conservado en los 3 sistemas. Aun a través del proceso de maduración distintiva de cada uno de los tipos, todos los ARNcr contienen una secuencia espaciadora y una porción de la repetición en uno o ambos extremos. Es la secuencia parcial de repeticiones la que previene que el sistema CRISPR-Cas ataque al cromosoma ya que el apareamiento de bases más allá de la secuencia del espaciador es una señal de que pertenece a sí mismo y previene el corte de ADN en el cromosoma.[90]​ Las enzimas de CRISPR guiadas por ARN se clasifican como enzimas de restricción tipo V.

Proteína asociada a CRISPR
 
Estructura cristalina de una proteína asociada a CRISPR de Thermus thermophilus
Identificadores
Símbolo CRISPR_assoc
Pfam PF08798
clanPfam CL0362
InterPro IPR010179
CDD cd09727
Estructuras disponibles:
Pfam
PDB RCSB PDB; PDBe; PDBj
PDBsum resumen de estructuras
Proteína asociada a CRISPR Cas2
 ]
Estructura cristalina de la proteína hipotética tt1823 de Thermus thermophilus
Identificadores
Símbolo CRISPR_Cas2
Pfam PF09827
InterPro IPR019199
CDD cd09638
Estructuras disponibles:
Pfam
PDB RCSB PDB; PDBe; PDBj
PDBsum resumen de estructuras
Proteína asociada a CRISPR Cse1
Identificadores
Symbol CRISPR_Cse1
Pfam PF09481
InterPro IPR013381
CDD cd09729
Estructuras disponibles:
Pfam
PDB RCSB PDB; PDBe; PDBj
PDBsum resumen de estructuras
Proteína asociada a CRISPR Cse2
Identificadores
Símbolo CRISPR_Cse2
Pfam PF09485
InterPro IPR013382
CDD cd09670
Estructuras disponibles:
Pfam
PDB RCSB PDB; PDBe; PDBj
PDBsum resumen de estructuras

Mutaciones aleatorias

En 2017 se demostró en un estudio[91]​ que este tipo de ingeniería genética puede generar centenares de mutaciones aleatorias no esperadas.

Dos días después de esta publicación, la reconocida revista Science publica un artículo que pone en entredicho la veracidad de este estudio crítico.[92]​ Diferentes estudios anteriores muestran un alto nivel de especificidad de CRISPR.[93]​[94]​[95]​

Para la comprobación de estas mutaciones aleatorias o fuera de la región diana ("off targets" en inglés) de las guías diseñadas han surgido herramientas de estudio de estas regiones de una forma automatizada como la herramienta VIVO.[96]​[97]​ VIVO es un “sistema de detección in vivo de off-targets”. Esta herramienta es un método eficiente para la detección de las zonas de edición fuera de la región diana a la cual orientamos las guías RNA del sistema de edición genómica CRISPR /Cas. Actualmente es el único método que cuenta con una observación inicialmente in vitro de los posibles off-targets de las guías con una posterior comprobación in vivo de la acción real de las guías RNA. El sistema VIVO nos permite detectar y cuantificar las regiones fuera de la diana o "target" de las nucleasas, de esta forma se busca definir que generando una guía RNA bien diseñada esta carece de off-targets o mutaciones aleatorias.

El sistema VIVO se compone de dos etapas consecutivas:

a) CIRCLEseq : es un método in vitro para la determinación de los posibles off-targets que puede generar una RNA guía en unas células determinadas. Esta etapa se basa en la localización de regiones del DNA donde pueda producir un corte la Cas9 debido a que estas regiones son complementarias a los RNA guías diseñados. Esas regiones del DNA se cortan y se anillan, dando lugar a fragmentos circulares de DNA con regiones para el corte mediado por Cas9 y otras sin región reconocida por la Cas9 que se van a degradar mediante un tratamiento con exonucleasas. Los fragmentos circulares deseados se someten a una linealización mediante el uso de la Cas9 .Los fragmentos lineales adquieren un ligando adaptador, se someten a PCR y posteriormente se analizan mediante técnicas de secuenciación. Cada una de las secuencias obtenidas corresponderá a un posible off-target de la Cas9 mediante el uso de las guías diseñadas.

b) Comprobación in vivo: a partir de los datos obtenidos mediante CIRLCE seq se comprueba que realmente se produce un corte en esas regiones del DNA mediante la Cas9 in vivo .Para ello se utiliza un tejido al que se aplica las Cas9 y se observa si las regiones predichas por CIRCLE seq realmente se cortan por las nucleasas.

Evolución, diversidad

Estudios en Streptococcus thermophilus fueron los primeros indicativos de cómo los CRISPRs mueven a la evolución de fagos y bacterias. Un espaciador CRISPR debe corresponder perfectamente a la secuencia del gen objetivo del fago. Los fagos pueden seguir infectando a sus hospederos cuando hay mutaciones puntuales en el espaciador.[90]​ Se siguen requerimientos similares en el PAM o la cepa seguirá siendo sensible a fagos.[62]​[90]​ El modelo básico de evolución CRISPR se explica como el modelo donde los espaciadores recientemente incorporados llevan a los fagos a mutar sus genomas creando diversidad en las poblaciones tanto de fagos y bacterias.

La evolución CRISPR ha sido estudiada usando la genómica comparativa de muchas cepas de S. thermophilus, Escherichia coli y Salmonella enterica. Un estudio de 124 cepas de S. thermophilus mostró que 26% de todos los espaciadores eran únicos y que los diferentes locus de CRISPR mostraban diferentes tasas de adquisición de espaciadores.[61]​ Los resultados mostraron que un locus de CRISPR particular puede evolucionar más rápidamente que otros, lo cual ayuda a establecer relaciones filogenéticas entre cepas. Un análisis similar de cepas de E. coli y S. enterica reveló que evolucionaron mucho más lentamente que S. thermophilus. Las cepas de esta última que habían divergido hace más de 250,000 años todavía contenían el mismo complemento de espaciador.[98]​

La diversidad de CRISPR se estudió en múltiples comunidades ambientales usando metagenómica. El análisis de los biofilms de los drenajes ácidos de dos minas mostró que uno de los CRISPRs analizados contenía deleciones y espaciadores extensivos en comparación con el otro biofilm, lo cual sugiere una mayor actividad de fagos en una comunidad que en otra.[42]​ En la cavidad oral, un estudio temporal determinó que aproximadamente del 7 al 22% de los espaciadores eran compartidos en períodos en el tiempo a lo largo de 17 meses en un mismo individuo y menos del 2% de los espaciadores fueron compartidos entre diferentes individuos en cualquier período en el tiempo.[69]​ Del mismo ambiente, se aisló una cepa particular usando primers de PCR específicos para su CRISPR. A diferencia de los resultados generales de la presencia/ausencia de los espaciadores, los cuales mostraban diversidad significativa, este CRISPR añadió 3 espaciadores a lo largo de 17 meses,[69]​ lo que sugiere que incluso en un ambiente con diversidad importante de CRISPR algunos locus evolucionan lentamente. Los CRISPRs también han sido analizados desde los metagenomas producidos por el proyecto del microbioma humano.[99]​ Aunque la mayoría de los CRISPRs eran específicos en un sitio, algunos CRISPRs dentro del sitio eran ampliamente encontrados entre individuos. Uno de esos locus de CRISPR se originó con estudios de especies de Streptococcus y contuvieron ~15,000 espaciadores, 50% de los cuales eran únicos. De modo similar a los estudios dirigidos de la cavidad oral, algunos de los CRISPRs mostraron poca evolución entre períodos en el tiempo.[99]​

La evolución CRISPR ha sido estudiada en quimiostatos usando S. thermophilus para examinar de manera explícita la tasa de adquisición de espaciadores. En el período de una semana, cepas de S. thermophilus adquirieron hasta tres espaciadores cuando eran expuestos ante solo un fago.[100]​ En el mismo periodo de tiempo, el fago desarrolló varios SNPs que se quedaron fijos es la población, lo que sugiere que CRISPR había prevenido la replicación de todos los otros tipos de fagos sin estas mutaciones.[100]​ Otros experimentos, también con S. thermophilus, mostraron que los fagos pueden infectar y replicarse en hospederos que tienen solo un espaciador y que los hospederos sensibles existen en ambientes con altas concentraciones de fagos.[101]​ Los estudios por quimiostatos y observaciones en los CRISPRs sugieren muchas consecuencias al resultado de la evolución de CRISPR y fagos.

Identificación bioinformática de los CRISPR en genomas y metagenomas

Los CRISPRs están altamente distribuidos entre bacterias y arqueas[43]​ y muestran similitudes en las secuencias,[77]​ sin embargo su característica principal son sus espaciadores repetidos y repeticiones directas. Esta característica hace a los CRISPRs fáciles de identificar en largas secuencias de ADN, ya que el número de copias repetidas disminuye la posibilidad de una unión tipo falso positivo. En la actualidad hay tres programas utilizados para la identificación de repeticiones CRISPR que buscan repeticiones interespaciadas en secuencias grandes: CRT,[102]​ PILER-CR[103]​ y CRISPRfinder.[104]​

El análisis de los CRISPRs en los datos de metagenómica es mucho más demandante, ya que los locus de CRISPR no suelen ensamblarse debido a su naturaleza repetitiva ni por variación de cepas, lo cual confunde a los algoritmos. Mientras que hay muchos genomas de referencias disponibles, la PCR se puede utilizar para amplificar arreglos de CRISPR y así analizar el contenido de los espaciadores.[61]​[69]​[105]​[106]​[107]​ Sin embargo, este enfoque solamente dará información de CRISPRs específicamente buscados y en organismos con suficiente representación en bases de datos públicas para poder hacer el diseño de primers de PCR confiables.

El enfoque alterativo es extraer y reconstruir los arreglos de CRISPR arrays basándose en datos shotgun metagenómicos. La identificación de los arreglos de CRISPR de lecturas metagenómias es una tarea computacionalmente más difícil, particularmente con las tecnologías de secuenciación de segunda generación (como son 454, Illumina), ya que las longitudes cortas previenen que más de dos o tres unidades repetidas se presenten en una sola lectura. La identificación de CRISPR en lecturas crudas se logra usando puramente identificación denovo[108]​ o al usar secuencias repetidas directas en arreglos CRISPR parcialmente ordenados[99]​ como herramienta para identificar repeticiones directos en lecturas individuales.

Importancia evolutiva

Un estudio bioinformático mostró que los CRISPRs son evolutivamente conservados y que se pueden aglomerar en tipos relacionados. Muchos muestran la posibilidad de una estructura secundaria conservada.[77]​

A través del mecanismo CRISPR/Cas, las bacterias pueden adquirir inmunidad a ciertos fagos y por ende detener la consecuente transmisión de estos fagos. Por esta razón los CRISPR/Cas se describen como un mecanismo de herencia Lamarckiano.[109]​ Otros han investigado la coevolución de los genomas vitales y hospederos.[110]​

Las proteínas Cas9 están altamente enriquecidas en bacterias patogénicas y comensales. La regulación mediada por CRISPR/Cas puede contribuir a la regulación de los genes endógenos bacterianos, particularmente en la interacción bacteriana con hospederos eucariontes. Por ejemplo, la proteína Cas9 de Francisella novicida usa un pequeño y único ARN asociado a CRISPR/Cas para reprimir un transcrito endógeno que codifica para una lipoproteína bacteriana que es crítica para F. novicida para reducir la respuesta del hospedero y promover la virulencia.[111]​

Aplicaciones

La prueba que demostró el principio de la redirección específica del sistema CRISPR/Cas llegó en 2012[112]​ y fue un primer paso para la materialización de propuestas para la biotecnología derivada de CRISPR:[113]​

  • Inmunización artificial contra fagos por introducción de locus CRISPR en bacterias industrialmente importantes, incluyendo a esas utilizadas en la producción de comida y fermentaciones a gran escala.
  • La ingeniería genética a nivel celular u organísmico al reprogramar un sistema CRISPR/Cas para lograr ingeniería del genoma guiada por ARN. Los estudios lo han demostrado tanto in vitro[23]​[48]​ como in vivo[30]​[114]​[115]​[116]​
  • Discriminación de cepas bacterianas por comparación de secuencias espaciadoras

Terapias

Editas Medicine, una start up de 43 millones de dólares, busca desarrollar tratamientos que usen CRISPR/Cas para hacer ediciones desde pares de bases específicas hasta segmentos más grandes de ADN. Algunas enfermedades heredadas como la fibrosis quística y la anemia son causadas por mutaciones de un solo par de bases; la tecnología CRISPR/Cas tiene el potencial de corregir esos errores. El gen "corregido" permanece en su lugar habitual en su cromosoma, quien contiene la forma en que la célula normalmente activa o inhibe su expresión.[117]​

Después de cultivar precursores de células sanguíneas llamados hemocitoblastos de la médula ósea de un paciente, la cirugía genética con CRISPR podría corregir el gen defectuoso. Entonces las células con el genoma corregido serían reintroducidas a la médula del paciente, que ahora producirá células sanas. Reemplazar el 70% de las células defectuosas significaría tener una cura.[38]​ Antes de que pueda usarse clínicamente, la compañía debe poder garantizar que solo la región objetivo será afectada y debe determinar cómo entregar la terapia a las células del paciente.[117]​ En 2014, investigadores de la UCSF usaron a los CRISPR para crear versiones sanas de células madre de pacientes con beta-talasemia.[118]​ En 2020 la empresa CRISPR Therapeutics anunció que a junio de 2020, 5 pacientes con beta-talasemia, y dos pacientes con anemia falciforme, habían sido tratados exitosamente con CTX001.[119]​ CTX001 es una terapia en desarrollo que las empresas Vertex Pharmaceuticals y CRISPR Therapeutics tienen en desarrollo.[120]​ En la noticia se indicó que dos pacientes de beta-talasemia a los 5 y 15 meses después de la edición del gen que reprime la expresión del gen de la hemoglobina fetal (HbF) eran independientes de transfusiones; y que un paciente que presenta la enfermedad de células falciformes, o anemia falciforme, a los 9 meses de la edición CTX001 se presenta libre de las crisis vasooclusivas de la enfermedad.

Otras patologías que se podrían tratar con CRISPR incluyen la enfermedad de Huntington, los efectos de la vejez, esquizofrenia y autismo e inclusive la modificación de ADN en embriones vivos.[38]​

Mejorar el sistema de dirección es fundamental antes de que CRISPR pueda ser utilizado en aplicaciones médicas. Los ARN guía existentes podrían trabajar sobre secuencias que difieren en algunas pares de bases de la secuencia objetivo.[22]​

Modelos murinos

CRISPR simplifica la creación de modelos de ratones y reduce el tiempo requerido de meses a tan solo semanas. El knockdown de genes endógenos ha sido logrado por transfección con un plásmido que contiene un área CRISPR con un espaciador, que inhibe un gen objetivo. La inyección de cigotos de ratón con Cas9 y dos ARN guía pudo lograr desactivar dos genes con el 80% de eficacia. La llamada reparación dirigida por homología involucra el uso de Cas9 para "cortar" al ADN, y así introducir nuevas partes génicas al cigoto.Plantilla:Obra citada needed

Agricultura

 
Librería de gusano de la seda con CRISPR Cas9

En 2014, el investigador chino Gao Caixia aplicó para patentes para la creación de una cepa de trigo que es resistente al oídio. A la cepa le faltan genes que producen proteínas que reprimen las defensas en contra del oídio. Los investigadores borraron todas las copias de los genes del genoma hexaploide del trigo. La cepa promete reducir o eliminar el gran uso de fungicidas para controlar la enfermedad. Gao usó los sistemas de edición génica transcription activator-like effector nuclease (TALENs) y CRISPR para agregar o cambiar ningún otro gen. Aún no ha habido pruebas de campo.[121]​[122]​

Entomología

En las células diploides eucariotas los análisis de perdida de función se han realizado primariamente por siRNA. En cambio, en los últimos años la tecnología CRISPR asociada a la proteína Cas9 ha adquirido una gran importancia. El sistema CRISPR es eficiente identificando genes en la resistencia de fármacos, tumorogénesis, respuesta inmune, interacciones con patógenos e inmunoterapia para el cáncer. Un ejemplo de esto es el estudio realizado en Bombyx mori que identificó los genes relacionados con su viabilidad celular, crecimiento, interacciones huésped-patógeno y resistencia a la temperatura, caracterizando más de 6000 genes diferentes.[123]​

Identificación de elementos funcionales en regiones genómicas no codificantes

Marcadores moleculares como el estado epigenético, la accesibilidad a la cromatina, la vinculación de factores de transcripción y la conservación evolutiva, se correlacionan con elementos funcionales putativos en el genoma no codificante y pueden predecir su función reguladora.[124]​ Sin embargo, estas predicciones superan en gran medida las regiones que carecen de características, y es difícil determinar qué características desempeñan un papel correlativo o verdaderamente causal en la función o en el fenotipo.

Los esfuerzos para determinar la causalidad se han basado en la utilización de fragmentos de ADN preseleccionados ,[125]​ basándose en su expresión como sustituto de la función, pero estos métodos carecen del contexto de la cromatina local y de las interacciones reguladoras más amplias. Por lo tanto, existe la necesidad de enfoques sistemáticos para cribar variantes no codificantes y determinar si y cómo afectan a los fenotipos en un contexto biológico nativo. Para ello, se diseñó un método de alto rendimiento que utilizaba una biblioteca de ARN guía en CRISPR-Cas9 para la detección genómica de locus no codificantes con el fin de identificar las regiones funcionales relacionadas con el fenotipo y la regulación de genes. En combinación con otros ensayos de todo el genoma, se demuestra el alto rendimiento de la técnica en la identificación de las regiones donde los cambios en el contexto de la cromatina y factores de transcripción que se unen a estas regiones están causalmente vinculados a la pérdida de expresión génica y un fenotipo relevante de la enfermedad.[126]​[127]​

Un ejemplo aplicado de esta técnica es la detección de localizaciones genómicas no codificantes que modulan la resistencia a los fármacos:

El Vemurafenib inhibe las proteínas B-Raf portadoras de la mutación[128]​ (cambio de valina por glutamato en la posición 600), que se encuentra en el 50 al 70% de los melanomas.[129]​ La resistencia al vemurafenib surge en cuestión de meses en casi todos los pacientes con melanoma, y las células tumorales supervivientes muestran un aumento de la malignidad que conduce rápidamente a la letalidad.[130]​[131]​ Una criba de CRISPR a escala genómica encontró que las mutaciones de pérdida de función en los genes NF1, NF2 y CUL3 producen resistencia a vemurafenib.[132]​ Para explorar si las mutaciones en las regiones no codificantes, alrededor de estos tres genes, podrían afectar de manera similar a la resistencia a los fármacos, se hizo uso de tres bibliotecas de sgRNAs que mapeaban a lo largo de 100kb en las regiones 5' y 3' de las principales isoformas de cada gen. Se concluyó que las mutaciones en la región no codificante 5' del gen CUL3 alteran los entornos locales epigenéticos y la interacción con distintos factores de transcripción (yin yang 1 (YY1), zinc finger protein 263 (ZNF263), CCCTC-binding factor (CTCF), y el complejo activation-protein 1 (AP-1) formado por Jun:Fos). Estas regiones no codificantes son de alta importancia en la regulación de genes y la resistencia quimioterapéutica y farmacológica.

En reproducción humana.

 
Este artículo o sección necesita referencias que aparezcan en una publicación acreditada.
Puedes avisar al redactor principal pegando lo siguiente en su página de discusión: {{sust:Aviso referencias|CRISPR}} ~~~~
Este aviso fue puesto el 11 de enero de 2022.

La técnica CRISPR y la edición génica podría tener un gran potencial en el campo de la tecnología de la reproducción humana. Por ejemplo, se podrían modificar mutaciones genéticas que puedan hacer peligrar la vida del individuo. Sin embargo, actualmente el uso de CRISPR y la edición genética en este campo aún está en proceso por asuntos de legalidad y bioéticos principalmente. No obstante, cabe destacar una noticia relevante en este campo: dos mellizas chinas fueron modificadas genéticamente mediante CRISPR para conseguir que fueran resistentes contra el VIH (virus causante del SIDA).

Funciones

Edición

Los CRISPRs pueden agregar y eliminar pares de bases en locus de ADN altamente específicos. Se han usado los CRISPRs para cortar más de cinco genes a la vez.[22]​

Knockout reversible

Los "CRISPRi", análogos a los ARNi, tienen la capacidad de desactivar los genes en un modo reversible al ser específicos pero sin hacer cortes. En bacterias, la presencia es lo único que se necesita para detener la transcripción, pero en aplicaciones de mamíferos, una sección de proteína es añadida. Guía al ARN que es específico para el ADN regulatorio, que son promotores que preceden al gen de interés.[22]​

Activación

La Cas9 se usó para llevar factores de transcripción sintéticos (fragmentos proteicos que encienden genes) que activaban genes humanos específicos. Esta técnica logró un fuerte efecto al dirigir múltiples constructos de CRISPR a lugares ligeramente diferentes en el promotor del gen.[22]​

Los genes incluían algunos atados a enfermedades humanas, diferenciación muscular, cáncer, inflamación y de producción de hemoglobina fetal.[22]​

Uso por fagos

Otro mecanismo para la defensa de las bacterias contra invasión de fagos es teniendo islas genómicas. Un subtipo de islas llamada phage-inducible chromosomal island (PICI) es cortada del cromosoma bacteriano cuando se presenta la infección por fago y puede inhibir su replicación.[133]​ Los mecanismos que inducen el sistema PICI y cómo PICI inhibe la replicación del fago no se tienen entendidos hasta ahora. Un estudio mostró que el fago lítico ICP1, el cual específicamente ataca al serotipo 01 de Vibrio cholerae ha adquirido un sistema CRISPR/Cas que apunta a un elemento de tipo PICI en V. cholera. El sistema tiene dos locus CRISPR y 9 genes Cas. Parece ser que es homólogo al sistema 1-F system encontrado en Yersinia pestis. Además, igual que el sistema bacteriano CRISPR/Cas el sistema ICP1 CRISPR/Cas puede adquirir nuevas secuencias, lo cual permite al fago co-evolucionar con su hospedador.[134]​

Automatización y soporte de librerías

Existe software gratuito para diseñar ARN para poder identificar cualquier gen deseado. El repositorio de Addgene ofrece a los académicos la posibilidad de crear su propio sistema ”CRISPR system" por 65 dólares. En 2013 Addgene distribuyó más de 10 000 constructos de CRISPR. La asociación ha recibido secuencias génicas activadoras de CRISPR de 11 equipos de investigación independientes.[22]​

Propiedad intelectual

Hasta diciembre de 2014, los derechos sobre la patente de CRISPR están impugnados.[135]​

Una aplicación de patente provisional sobre el uso del sistema CRISPR para la edición de genes y regulación de expresión génica fue solicitada por el equipo de Doudna el 12 de mayo de 2012. Aplicaciones subsecuentes fueron combinadas el 6 de marzo de 2014, con los resultados siendo publicados por la oficina de patentes estadounidense (USPTO).[136]​ Los derechos de patente han sido asignados por los inventores a los regentes de la Universidad de California y la Universidad de Viena.

Por su parte, Feng Zhang en el Broad Institute, que había desarrollado y demostrado la tecnología CRISPR en células humanas, ha obtenido una patente de CRISPR para células con núcleo: células de animales (incluidos los humanos) y de plantas. Según Zhang, las predicciones formuladas por Doudna en su propia aplicación de patente de que su descubrimiento podría funcionar en humanos fueron una "mera conjetura", mientras que él fue el primero en demostrarlo en un acto de invención separado y "sorprendente".[137]​ Esta segunda patente es controvertida, ya que otros científicos sugieren que, en términos de propiedad intelectual, era "obvio" que la tecnología CRISPR funcionaría en células humanas y por tanto la "invención de Zhang no sería merecedora de una patente propia.[137]​ Desde diciembre de 2014 se espera que Doudna y Charpentier planteen su oposición contra la patente del Broad Institute.

En febrero de 2017, la Oficina de Patentes de los Estados Unidos se pronunció sobre un caso de interferencia de patente presentado por la Universidad de California con respecto a las patentes emitidas al Broad Institute, y encontró que las patentes Broad, con reivindicaciones que abarcaban la aplicación de CRISPR/cas9 en células eucariotas, eran distintas de los inventos reclamados por la Universidad de California.[138]​[139]​[140]​

Hasta noviembre de 2013, SAGE Labs (ahora parte del grupo Horizon Discovery) tenía derechos exclusivos de una de esas empresas para producir y vender ratas genéticamente modificadas y derechos no exclusivos para modelos de ratones y conejos.[141]​ En 2015, Thermo Fisher Scientific había autorizado la propiedad intelectual de ToolGen para desarrollar kits de reactivos CRISPR.[142]​

Hay que aclarar que el sistema CRISPR fue descubierto por primera vez, por un grupo de científicos japoneses en 1987 liderado por Yoshizumi Ishino,[11]​[12]​ años después fue encontrado de nuevo de forma independiente por el microbiólogo alicantino Francis Mojica, actual profesor titular de la Universidad de Alicante.[143]​[144]​

Cortadores alternativos

  •  

    CRISPR-DR2: Estructura secundaria tomada de la base de datos Rfam Familia RF01315.

  •  

    CRISPR-DR5: Estructura secundaria tomada de la base de datos Rfam Familia RF011318.

  •  

    CRISPR-DR6: Estructura secundaria tomada de la base de datos Rfam Familia RF01319.

  •  

    CRISPR-DR8: Estructura secundaria tomada de la base de datos Rfam Familia RF01321.

  •  

    CRISPR-DR9: Estructura secundaria tomada de la base de datos Rfam Familia RF01322.

  •  

    CRISPR-DR19: Estructura secundaria tomada de la base de datos Rfam Familia RF01332.

  •  

    CRISPR-DR41: Estructura secundaria tomada de la base de datos Rfam Familia RF01350.

  •  

    CRISPR-DR52: Estructura secundaria tomada de la base de datos Rfam Familia RF01365.

  •  

    CRISPR-DR57: Estructura secundaria tomada de la base de datos Rfam Familia RF01370.

  •  

    CRISPR-DR65: Estructura secundaria tomada de la base de datos Rfam Familia RF01378.

Riesgos

Según investigadores del Instituto Wellcome Sanger en Inglaterra, la edición genética puede llevar a mutaciones no directamente relacionadas con el sitio de edición del genoma. La complejidad y la interrelación entre genes editados y no editados podría afectar a la salud de personas con genes editados.[145]​ En su monografía El fenotipo revolucionario (The revolutionary phenotype), el neurólogo canadiense Jean-François Gariépy desarrolla una teoría basada en la Hipótesis del mundo de ARN en que la edición del genoma humano podría llegar a un reemplazo de la reproducción biológica. En lugar de la presente reproducción biológica, podría formarse una reproducción controlada por científicos usando programas informáticos para cumplir los deseos de los padres eligiendo una edición genética para sus hijos.[146]​

Véase también

Referencias

  1. ↑ Horvath, P.; Barrangou, R. (2010). «CRISPR/Cas, the Immune System of Bacteria and Archaea». Science 327 (5962): 167-170. PMID 20056882. doi:10.1126/science.1179555. 
  2. «Flores, J. (2016, enero 5). Los orígenes bacterianos de la edición del genoma. La Jornada, sección Ciencias, p. 3a, suplemento La Jornada de enmedio. México: DEMOS. (Consultado 6 de enero del 2016)». Consultado el 5 de abril de 2017. 
  3. ↑ Marraffini LA, Sontheimer EJ (March 2010). «CRISPR interference: RNA-directed adaptive immunity in bacteria and archaea». Nature Reviews Genetics 11 (3): 181-190. PMC 2928866. PMID 20125085. doi:10.1038/nrg2749. 
  4. CRISPRdb 71/79 Archaea, 463/1008 Bacteria, Date: 19.6.2010
  5. ↑ Grissa, I.; Vergnaud, G.; Pourcel, C (2007). «The CRISPRdb database and tools to display CRISPRs and to generate dictionaries of spacers and repeats». BMC Bioinformatics 8: 172. PMC 1892036. PMID 17521438. doi:10.1186/1471-2105-8-172. 
  6. Barrangou, R.; Fremaux, C.; Deveau, H.; Richards, M.; Boyaval, P.; Moineau, S.; Romero, D. A.; Horvath, P. (2007). «CRISPR Provides Acquired Resistance Against Viruses in Prokaryotes». Science 315 (5819): 1709-1712. PMID 17379808. doi:10.1126/science.1138140. 
  7. ↑ Marraffini LA, Sontheimer EJ. (2008). «CRISPR interference limits horizontal gene transfer in staphylococci by targeting DNA.». Science 322 (5909): 1843-5. PMID 19095942. 
  8. Mali P, Esvelt KM, Church GM (2013). «Cas9 as a versatile tool for engineering biology». Nature methods 10 (10957-63). PMID 24076990. 
  9. Kevin M Esvelt, Andrea L Smidler, Flaminia Catteruccia, George M Church (2014). «Concerning RNA-guided gene drives for the alteration of wild populations». eLife. doi:10.7554/eLife.03401. 
  10. Overballe-Petersen S, Harms K, Orlando LA, Mayar JV, Rasmussen S, Dahl TW, Rosing MT, Poole AM, Sicheritz-Ponten T, Brunak S, Inselmann S, de Vries J, Wackernagel W, Pybus OG, Nielsen R, Johnsen PJ, Nielsen KM, Willerslev E. (2013). «Bacterial natural transformation by highly fragmented and damaged DNA». Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (49): 19860-5. 
  11. ↑ http://jb.asm.org/content/169/12/5429.long Nucleotide Sequence of the iap Gene, Responsible for Alkaline Phosphatase Isozyme Conversion in Escherichia coli, and Identification of the Gene Product
  12. ↑ Ishino Y, Shinagawa H, Makino K, Amemura M, Nakata A. (1987). «Nucleotide sequence of the iap gene, responsible for alkaline phosphatase isozyme conversion in Escherichia coli, and identification of the gene product.». J Bacteriol. 169 (12): 5429-33. 
  13. Mojica, F. J.; Juez, G.; Rodríguez-Valera, F. (1 de agosto de 1993). «Transcription at different salinities of Haloferax mediterranei sequences adjacent to partially modified PstI sites». Molecular Microbiology 9 (3): 613-621. ISSN 0950-382X. PMID 8412707. Consultado el 20 de enero de 2016. 
  14. Hermans, P. W.; van Soolingen, D.; Bik, E. M.; de Haas, P. E.; Dale, J. W.; van Embden, J. D. (1 de agosto de 1991). «Insertion element IS987 from Mycobacterium bovis BCG is located in a hot-spot integration region for insertion elements in Mycobacterium tuberculosis complex strains». Infection and Immunity 59 (8): 2695-2705. ISSN 0019-9567. PMC 258075. PMID 1649798. Consultado el 20 de enero de 2016. 
  15. Groenen, P. M.; Bunschoten, A. E.; van Soolingen, D.; van Embden, J. D. (1 de diciembre de 1993). «Nature of DNA polymorphism in the direct repeat cluster of Mycobacterium tuberculosis; application for strain differentiation by a novel typing method». Molecular Microbiology 10 (5): 1057-1065. ISSN 0950-382X. PMID 7934856. Consultado el 20 de enero de 2016. 
  16. Mojica, F. J.; Ferrer, C.; Juez, G.; Rodríguez-Valera, F. (1 de julio de 1995). «Long stretches of short tandem repeats are present in the largest replicons of the Archaea Haloferax mediterranei and Haloferax volcanii and could be involved in replicon partitioning». Molecular Microbiology 17 (1): 85-93. ISSN 0950-382X. PMID 7476211. Consultado el 20 de enero de 2016. 
  17. Mojica FJ, Díez-Villaseñor C, Soria E, Juez G. (2000). «Biological significance of a family of regularly spaced repeats in the genomes of Archaea, Bacteria and mitochondria». Mol Microbiol 36 (1): 244-6. PMID 10760181. 
  18. ↑ Jansen R, Embden JD, Gaastra W, Schouls LM (2002). «Identification of genes that are associated with DNA repeats in prokaryotes». Mol Microbiol 43 (6): 1565-75. 
  19. ↑ Pourcel C, Salvignol G, Vergnaud G. (2005). «CRISPR elements in Yersinia pestis acquire new repeats by preferential uptake of bacteriophage DNA, and provide additional tools for evolutionary studies». Microbiology 151 (Pt 3): 653-63. 
  20. ↑ Bolotin A, Quinquis B, Sorokin A, Ehrlich SD (2005). «Clustered regularly interspaced short palindrome repeats (CRISPRs) have spacers of extrachromosomal origin». Microbiology 151 (Pt 8): 2551-61. 
  21. ↑ Mojica, Francisco J. M.; Díez-Villaseñor, César; García-Martínez, Jesús; Soria, Elena (1 de febrero de 2005). «Intervening sequences of regularly spaced prokaryotic repeats derive from foreign genetic elements». Journal of Molecular Evolution 60 (2): 174-182. ISSN 0022-2844. PMID 15791728. doi:10.1007/s00239-004-0046-3. Consultado el 20 de enero de 2016. 
  22. ↑ Pennisi E (2013). «The CRISPR craze». Science 341 (6148): 833-6. 
  23. ↑ Jinek M, Chylinski K, Fonfara I, Hauer M, Doudna JA, Charpentier E (2012). «A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity». Science 337 (6096): 816-21. 
  24. «CRISPR gene therapy: Scientists call for more public debate around breakthrough technique - Science - News"». The Independent. 7 de noviembre de 2013. 
  25. DiCarlo JE, Norville JE, Mali P, Rios X, Aach J, Church GM (2013). «Genome engineering in Saccharomyces cerevisiae using CRISPR-Cas systems». Nucleic Acids Res 41 (7): 4336-43. 
  26. Hwang WY, Fu Y, Reyon D, Maeder ML, Tsai SQ, Sander JD, Peterson RT, Yeh JR, Joung JK (2013). «Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system». Nat Biotechnol 31 (3): 227-9. 
  27. Gratz SJ, Cummings AM, Nguyen JN, Hamm DC, Donohue LK, Harrison MM, Wildonger J, O'Connor-Giles KM (2013). «Genome engineering of Drosophila with the CRISPR RNA-guided Cas9 nuclease». Genetics 194 (4): 1029-35. 
  28. Friedland AE, Tzur YB, Esvelt KM, Colaiácovo MP, Church GM, Calarco JA (2013). «Heritable genome editing in C. elegans via a CRISPR-Cas9 system». Nat Methods 10 (8): 741-3. 
  29. Jiang W, Zhou H, Bi H, Fromm M, Yang B, Weeks DP (2013). «Demonstration of CRISPR/Cas9/sgRNA-mediated targeted gene modification in Arabidopsis, tobacco, sorghum and rice». Nucleic Acids Res 41 (20): e188. 
  30. ↑ Wang H, Yang H, Shivalila CS, Dawlaty MM, Cheng AW, Zhang F, Jaenisch R (2013). «One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering». Cell 153 (4): 910-8. 
  31. Larson MH, Gilbert LA, Wang X, Lim WA, Weissman JS, Qi LS (2013). «CRISPR interference (CRISPRi) for sequence-specific control of gene expression». Nat Protoc 8 (11): 2180-96. 
  32. «Researchers reverse a liver disorder in mice by correcting a mutated gene». PhysOrg. 30 de marzo de 2014. Consultado el 31 de marzo de 2014. 
  33. Zetsche B; Gootenberg JS, Abudayyeh OO, Slaymaker IM, Makarova KS, Essletzbichler P, Volz SE, Joung J, van der Oost J, Regev A, Koonin EV, Zhang F (October 2015). «Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system». Cell 163 (3): 759-71. PMID 26422227. doi:10.1016/j.cell.2015.09.038. 
  34. Fonfara I; Richter H, Bratovič M, Le Rhun A, Charpentier E (April 2016). «The CRISPR-associated DNA-cleaving enzyme Cpf1 also processes precursor CRISPR RNA». Nature 532 (7600): 517-21. PMID 27096362. doi:10.1038/nature17945. 
  35. Ewen-Campen, B.; Perrimon, N. (2020). Expanding the horizons of genome editing in the fruit fly with Cas12a 117 (39). pp. 24019-24021. doi:10.1073/pnas.2016446117. Consultado el 18 de enero de 2021. 
  36. Pausch, P.; Al-Shayeb, B.; Bisom-Rapp, E.; Tsuchida, C. A.; Li, Z.; Cress, B. F.; ...; Doudna, J. A. (2020). CRISPR-CasΦ from huge phages is a hypercompact genome editor 369 (6501). pp. 333-337. doi:10.1126/science.abb1400. Consultado el 25 de enero de 2021. 
  37. Bosh, J. A.; Birchak, G.; Perrimon, N. (2020). Precise genome engineering in Drosophila using prime editing 118 (1). doi:10.1073/pnas.2021996118. Consultado el 25 de enero de 2021. 
  38. ↑ Young, Susan (11 de febrero de 2014). «CRISPR and Other Genome Editing Tools Boost Medical Research and Gene Therapy’s Reach | MIT Technology Review». Technologyreview.com. Consultado el 13 de abril de 2014. 
  39. Shipman & al., Seth L. (12 de julio de 20147). «CRISPR–Cas encoding of a digital movie into the genomes of a population of living bacteria». Nature. Consultado el 16 de julio de 2017. 
  40. ↑ Haft DH, Selengut J, Mongodin EF, Nelson KE (2005). «A guild of 45 CRISPR-associated (Cas) protein families and multiple CRISPR/Cas subtypes exist in prokaryotic genomes». PLoS Comput Biol 1 (6): e60. 
  41. Stern A, Keren L, Wurtzel O, Amitai G, Sorek R (2010). «Self-targeting by CRISPR: gene regulation or autoimmunity?». Trends Genet 26 (8): 335-40. 
  42. ↑ Tyson, Gene W.; Banfield, Jillian F. (1 de enero de 2008). «Rapidly evolving CRISPRs implicated in acquired resistance of microorganisms to viruses». Environmental Microbiology 10 (1): 200-207. ISSN 1462-2920. PMID 17894817. doi:10.1111/j.1462-2920.2007.01444.x. Consultado el 8 de agosto de 2016. 
  43. ↑ Chylinski K, Makarova KS, Charpentier E, Koonin EV (2014). «Classification and evolution of type II CRISPR-Cas systems». Nucleic Acids Res 42 (10): 6091-105. 
  44. ↑ Wiedenheft, B; Sternberg, SH; Doudna, JA (15 de febrero de 2012). «RNA-guided genetic silencing systems in bacteria and archaea.». Nature 482 (7385): 331-8. PMID 22337052. 
  45. Sinkunas T, Gasiunas G, Fremaux C, Barrangou R, Horvath P, Siksnys V (2011). «Cas3 is a single-stranded DNA nuclease and ATP-dependent helicase in the CRISPR/Cas immune system». EMBO J 30 (7): 1335-42. 
  46. ↑ Aliyari R, Ding SW (2009). «RNA-based viral immunity initiated by the Dicer family of host immune receptors». Immunol Rev 227 (1): 176-88. 
  47. ↑ Makarova KS, Aravind L, Wolf YI, Koonin EV (2011). Unification of Cas protein families and a simple scenario for the origin and evolution of CRISPR-Cas systems 6. p. 38. 
  48. ↑ Gasiunas, Giedrius; Barrangou, Rodolphe; Horvath, Philippe; Siksnys, Virginijus (25 de septiembre de 2012). «Cas9-crRNA ribonucleoprotein complex mediates specific DNA cleavage for adaptive immunity in bacteria». Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 109 (39): E2579-2586. ISSN 1091-6490. PMC 3465414. PMID 22949671. doi:10.1073/pnas.1208507109. Consultado el 8 de agosto de 2016. 
  49. Chylinski K, Le Rhun A, Charpentier E (2013). «The tracrRNA and Cas9 families of type II CRISPR-Cas immunity systems». RNA Biol 10 (5): 726-37. 
  50. ↑ Dugar, Gaurav; Herbig, Alexander; Förstner, Konrad U.; Heidrich, Nadja; Reinhardt, Richard; Nieselt, Kay; Sharma, Cynthia M. (1 de mayo de 2013). «High-resolution transcriptome maps reveal strain-specific regulatory features of multiple Campylobacter jejuni isolates». PLoS genetics 9 (5): e1003495. ISSN 1553-7404. PMC 3656092. PMID 23696746. doi:10.1371/journal.pgen.1003495. Consultado el 8 de agosto de 2016. 
  51. Hatoum-Aslan, Asma; Maniv, Inbal; Marraffini, Luciano A. (27 de diciembre de 2011). «Mature clustered, regularly interspaced, short palindromic repeats RNA (crRNA) length is measured by a ruler mechanism anchored at the precursor processing site». Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 108 (52): 21218-21222. ISSN 1091-6490. PMC 3248500. PMID 22160698. doi:10.1073/pnas.1112832108. Consultado el 20 de mayo de 2016. 
  52. ↑ Yosef, Ido; Goren, Moran G.; Qimron, Udi (1 de julio de 2012). «Proteins and DNA elements essential for the CRISPR adaptation process in Escherichia coli». Nucleic Acids Research 40 (12): 5569-5576. ISSN 1362-4962. PMC 3384332. PMID 22402487. doi:10.1093/nar/gks216. Consultado el 8 de agosto de 2016. 
  53. ↑ Swarts, Daan C.; Mosterd, Cas; van Passel, Mark W. J.; Brouns, Stan J. J. (1 de enero de 2012). «CRISPR interference directs strand specific spacer acquisition». PloS One 7 (4): e35888. ISSN 1932-6203. PMC 3338789. PMID 22558257. doi:10.1371/journal.pone.0035888. Consultado el 8 de agosto de 2016. 
  54. Babu, Mohan; Beloglazova, Natalia; Flick, Robert; Graham, Chris; Skarina, Tatiana; Nocek, Boguslaw; Gagarinova, Alla; Pogoutse, Oxana et al. (1 de enero de 2011). «A dual function of the CRISPR-Cas system in bacterial antivirus immunity and DNA repair». Molecular Microbiology 79 (2): 484-502. ISSN 1365-2958. PMC 3071548. PMID 21219465. doi:10.1111/j.1365-2958.2010.07465.x. Consultado el 20 de mayo de 2016.  Babu, Mohan; Beloglazova, Natalia; Flick, Robert; Graham, Chris; Skarina, Tatiana; Nocek, Boguslaw; Gagarinova, Alla; Pogoutse, Oxana et al. (1 de enero de 2011). «A dual function of the CRISPR-Cas system in bacterial antivirus immunity and DNA repair». Molecular Microbiology 79 (2): 484-502. ISSN 1365-2958. PMC 3071548. PMID 21219465. doi:10.1111/j.1365-2958.2010.07465.x. Consultado el 20 de mayo de 2016. 
  55. Han, Dong; Lehmann, Kathleen; Krauss, Gerhard (18 de junio de 2009). «SSO1450--a CAS1 protein from Sulfolobus solfataricus P2 with high affinity for RNA and DNA». FEBS letters 583 (12): 1928-1932. ISSN 1873-3468. PMID 19427858. doi:10.1016/j.febslet.2009.04.047. Consultado el 20 de mayo de 2016. 
  56. Wiedenheft, Blake; Zhou, Kaihong; Jinek, Martin; Coyle, Scott M.; Ma, Wendy; Doudna, Jennifer A. (10 de junio de 2009). «Structural basis for DNase activity of a conserved protein implicated in CRISPR-mediated genome defense». Structure (London, England: 1993) 17 (6): 904-912. ISSN 1878-4186. PMID 19523907. doi:10.1016/j.str.2009.03.019. Consultado el 20 de mayo de 2016. 
  57. Beloglazova, Natalia; Brown, Greg; Zimmerman, Matthew D.; Proudfoot, Michael; Makarova, Kira S.; Kudritska, Marina; Kochinyan, Samvel; Wang, Shuren et al. (18 de julio de 2008). «A novel family of sequence-specific endoribonucleases associated with the clustered regularly interspaced short palindromic repeats». The Journal of Biological Chemistry 283 (29): 20361-20371. ISSN 0021-9258. PMC 2459268. PMID 18482976. doi:10.1074/jbc.M803225200. Consultado el 20 de mayo de 2016. 
  58. Samai, Poulami; Smith, Paul; Shuman, Stewart (1 de diciembre de 2010). «Structure of a CRISPR-associated protein Cas2 from Desulfovibrio vulgaris». Acta Crystallographica. Section F, Structural Biology and Crystallization Communications 66 (Pt 12): 1552-1556. ISSN 1744-3091. PMC 2998353. PMID 21139194. doi:10.1107/S1744309110039801. Consultado el 20 de mayo de 2016. 
  59. Nam, Ki Hyun; Ding, Fran; Haitjema, Charles; Huang, Qingqiu; DeLisa, Matthew P.; Ke, Ailong (19 de octubre de 2012). «Double-stranded endonuclease activity in Bacillus halodurans clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)-associated Cas2 protein». The Journal of Biological Chemistry 287 (43): 35943-35952. ISSN 1083-351X. PMC 3476262. PMID 22942283. doi:10.1074/jbc.M112.382598. Consultado el 20 de mayo de 2016. 
  60. ↑ Mojica, F. J. M.; Díez-Villaseñor, C.; García-Martínez, J.; Almendros, C. (1 de marzo de 2009). «Short motif sequences determine the targets of the prokaryotic CRISPR defence system». Microbiology (Reading, England) 155 (Pt 3): 733-740. ISSN 1350-0872. PMID 19246744. doi:10.1099/mic.0.023960-0. Consultado el 20 de enero de 2016. 
  61. ↑ Horvath, Philippe; Romero, Dennis A.; Coûté-Monvoisin, Anne-Claire; Richards, Melissa; Deveau, Hélène; Moineau, Sylvain; Boyaval, Patrick; Fremaux, Christophe et al. (1 de febrero de 2008). «Diversity, activity, and evolution of CRISPR loci in Streptococcus thermophilus». Journal of Bacteriology 190 (4): 1401-1412. ISSN 1098-5530. PMC 2238196. PMID 18065539. doi:10.1128/JB.01415-07. Consultado el 8 de agosto de 2016. 
  62. ↑ Deveau, Hélène; Barrangou, Rodolphe; Garneau, Josiane E.; Labonté, Jessica; Fremaux, Christophe; Boyaval, Patrick; Romero, Dennis A.; Horvath, Philippe et al. (1 de febrero de 2008). «Phage response to CRISPR-encoded resistance in Streptococcus thermophilus». Journal of Bacteriology 190 (4): 1390-1400. ISSN 1098-5530. PMC 2238228. PMID 18065545. doi:10.1128/JB.01412-07. Consultado el 8 de agosto de 2016. 
  63. ↑ Lillestøl, Reidun K.; Shah, Shiraz A.; Brügger, Kim; Redder, Peter; Phan, Hien; Christiansen, Jan; Garrett, Roger A. (1 de abril de 2009). «CRISPR families of the crenarchaeal genus Sulfolobus: bidirectional transcription and dynamic properties». Molecular Microbiology 72 (1): 259-272. ISSN 1365-2958. PMID 19239620. doi:10.1111/j.1365-2958.2009.06641.x. Consultado el 8 de agosto de 2016. 
  64. ↑ Shah SA, Hansen NR, Garrett RA (2009). «Distribution of CRISPR spacer matches in viruses and plasmids of crenarchaeal acidothermophiles and implications for their inhibitory mechanism». Biochem Soc Trans 37 (Pt 1): 23-8. 
  65. ↑ Díez-Villaseñor, César; Guzmán, Noemí M.; Almendros, Cristóbal; García-Martínez, Jesús; Mojica, Francisco J. M. (1 de mayo de 2013). «CRISPR-spacer integration reporter plasmids reveal distinct genuine acquisition specificities among CRISPR-Cas I-E variants of Escherichia coli». RNA biology 10 (5): 792-802. ISSN 1555-8584. PMC 3737337. PMID 23445770. doi:10.4161/rna.24023. Consultado el 8 de agosto de 2016. 
  66. ↑ Erdmann, Susanne; Garrett, Roger A. (1 de septiembre de 2012). «Selective and hyperactive uptake of foreign DNA by adaptive immune systems of an archaeon via two distinct mechanisms». Molecular Microbiology 85 (6): 1044-1056. ISSN 1365-2958. PMC 3468723. PMID 22834906. doi:10.1111/j.1365-2958.2012.08171.x. Consultado el 8 de agosto de 2016. 
  67. ↑ Shah, Shiraz A.; Erdmann, Susanne; Mojica, Francisco J. M.; Garrett, Roger A. (1 de mayo de 2013). «Protospacer recognition motifs: mixed identities and functional diversity». RNA biology 10 (5): 891-899. ISSN 1555-8584. PMC 3737346. PMID 23403393. doi:10.4161/rna.23764. Consultado el 8 de agosto de 2016. 
  68. Andersson, Anders F.; Banfield, Jillian F. (23 de mayo de 2008). «Virus population dynamics and acquired virus resistance in natural microbial communities». Science (New York, N.Y.) 320 (5879): 1047-1050. ISSN 1095-9203. PMID 18497291. doi:10.1126/science.1157358. Consultado el 20 de mayo de 2016. 
  69. ↑ Pride, David T.; Sun, Christine L.; Salzman, Julia; Rao, Nitya; Loomer, Peter; Armitage, Gary C.; Banfield, Jillian F.; Relman, David A. (1 de enero de 2011). «Analysis of streptococcal CRISPRs from human saliva reveals substantial sequence diversity within and between subjects over time». Genome Research 21 (1): 126-136. ISSN 1549-5469. PMC 3012920. PMID 21149389. doi:10.1101/gr.111732.110. Consultado el 8 de agosto de 2016. 
  70. ↑ Goren, Moran G.; Yosef, Ido; Auster, Oren; Qimron, Udi (12 de octubre de 2012). «Experimental definition of a clustered regularly interspaced short palindromic duplicon in Escherichia coli». Journal of Molecular Biology 423 (1): 14-16. ISSN 1089-8638. PMID 22771574. doi:10.1016/j.jmb.2012.06.037. Consultado el 8 de agosto de 2016. 
  71. ↑ Datsenko, Kirill A.; Pougach, Ksenia; Tikhonov, Anton; Wanner, Barry L.; Severinov, Konstantin; Semenova, Ekaterina (1 de enero de 2012). «Molecular memory of prior infections activates the CRISPR/Cas adaptive bacterial immunity system». Nature Communications 3: 945. ISSN 2041-1723. PMID 22781758. doi:10.1038/ncomms1937. Consultado el 8 de agosto de 2016. 
  72. Tang, TH; Bachellerie, JP; Rozhdestvensky, T; Bortolin, ML; Huber, H; Drungowski, M; Elge, T; Brosius, J et al. (28 de mayo de 2002). «Identification of 86 candidates for small non-messenger RNAs from the archaeon Archaeoglobus fulgidus.». Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 99 (11): 7536-41. PMID 12032318. 
  73. Tang, TH; Polacek, N; Zywicki, M; Huber, H; Brugger, K; Garrett, R; Bachellerie, JP; Hüttenhofer, A (de enero de 2005). «Identification of novel non-coding RNAs as potential antisense regulators in the archaeon Sulfolobus solfataricus.». Molecular microbiology 55 (2): 469-81. PMID 15659164. 
  74. Gesner, EM; Schellenberg, MJ; Garside, EL; George, MM; Macmillan, AM (de junio de 2011). «Recognition and maturation of effector RNAs in a CRISPR interference pathway.». Nature structural & molecular biology 18 (6): 688-92. PMID 21572444. 
  75. Sashital, DG; Jinek, M; Doudna, JA (de junio de 2011). «An RNA-induced conformational change required for CRISPR RNA cleavage by the endoribonuclease Cse3.». Nature structural & molecular biology 18 (6): 680-7. PMID 21572442. 
  76. Haurwitz, RE; Jinek, M; Wiedenheft, B; Zhou, K; Doudna, JA (10 de septiembre de 2010). «Sequence- and structure-specific RNA processing by a CRISPR endonuclease.». Science (New York, N.Y.) 329 (5997): 1355-8. PMID 20829488. 
  77. ↑ Kunin, Victor; Sorek, Rotem; Hugenholtz, Philip (1 de enero de 2007). «Evolutionary conservation of sequence and secondary structures in CRISPR repeats». Genome Biology 8 (4): R61. ISSN 1474-760X. PMC 1896005. PMID 17442114. doi:10.1186/gb-2007-8-4-r61. Consultado el 8 de agosto de 2016. 
  78. Carte, J; Wang, R; Li, H; Terns, RM; Terns, MP (15 de diciembre de 2008). «Cas6 is an endoribonuclease that generates guide RNAs for invader defense in prokaryotes.». Genes & development 22 (24): 3489-96. PMID 19141480. 
  79. Wang, R; Preamplume, G; Terns, MP; Terns, RM; Li, H (9 de febrero de 2011). «Interaction of the Cas6 riboendonuclease with CRISPR RNAs: recognition and cleavage.». Structure (London, England : 1993) 19 (2): 257-64. PMID 21300293. 
  80. Niewoehner, O; Jinek, M; Doudna, JA (de enero de 2014). «Evolution of CRISPR RNA recognition and processing by Cas6 endonucleases.». Nucleic acids research 42 (2): 1341-53. PMID 24150936. 
  81. Garneau, JE; Dupuis, MÈ; Villion, M; Romero, DA; Barrangou, R; Boyaval, P; Fremaux, C; Horvath, P; Magadán, AH; Moineau, S (4 de noviembre de 2010). «The CRISPR/Cas bacterial immune system cleaves bacteriophage and plasmid DNA.». Nature 468 (7320): 67-71. PMID 21048762. 
  82. Semenova, E; Jore, MM; Datsenko, KA; Semenova, A; Westra, ER; Wanner, B; van der Oost, J; Brouns, SJ et al. (21 de junio de 2011). «Interference by clustered regularly interspaced short palindromic repeat (CRISPR) RNA is governed by a seed sequence.». Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 108 (25): 10098-103. PMID 21646539. 
  83. Gudbergsdottir, S; Deng, L; Chen, Z; Jensen, JV; Jensen, LR; She, Q; Garrett, RA (de enero de 2011). «Dynamic properties of the Sulfolobus CRISPR/Cas and CRISPR/Cmr systems when challenged with vector-borne viral and plasmid genes and protospacers.». Molecular microbiology 79 (1): 35-49. PMID 21166892. 
  84. Manica, A; Zebec, Z; Teichmann, D; Schleper, C (de abril de 2011). «In vivo activity of CRISPR-mediated virus defence in a hyperthermophilic archaeon.». Molecular microbiology 80 (2): 481-91. PMID 21385233. 
  85. Jore, MM; Lundgren, M; van Duijn, E; Bultema, JB; Westra, ER; Waghmare, SP; Wiedenheft, B; Pul, U; Wurm, R; Wagner, R; Beijer, MR; Barendregt, A; Zhou, K; Snijders, AP; Dickman, MJ; Doudna, JA; Boekema, EJ; Heck, AJ; van der Oost, J; Brouns, SJ (de mayo de 2011). «Structural basis for CRISPR RNA-guided DNA recognition by Cascade.». Nature structural & molecular biology 18 (5): 529-36. PMID 21460843. 
  86. Wiedenheft, B; Lander, GC; Zhou, K; Jore, MM; Brouns, SJ; van der Oost, J; Doudna, JA; Nogales, E (21 de septiembre de 2011). «Structures of the RNA-guided surveillance complex from a bacterial immune system.». Nature 477 (7365): 486-9. PMID 21938068. 
  87. Zhang, J; Rouillon, C; Kerou, M; Reeks, J; Brugger, K; Graham, S; Reimann, J; Cannone, G; Liu, H; Albers, SV; Naismith, JH; Spagnolo, L; White, MF (10 de febrero de 2012). «Structure and mechanism of the CMR complex for CRISPR-mediated antiviral immunity.». Molecular cell 45 (3): 303-13. PMID 22227115. 
  88. ↑ Hale, Caryn R.; Zhao, Peng; Olson, Sara; Duff, Michael O.; Graveley, Brenton R.; Wells, Lance; Terns, Rebecca M.; Terns, Michael P. (25 de noviembre de 2009). «RNA-guided RNA cleavage by a CRISPR RNA-Cas protein complex». Cell 139 (5): 945-956. ISSN 1097-4172. PMC 2951265. PMID 19945378. doi:10.1016/j.cell.2009.07.040. Consultado el 8 de agosto de 2016. 
  89. Deng, Ling; Garrett, Roger A.; Shah, Shiraz A.; Peng, Xu; She, Qunxin (1 de marzo de 2013). «A novel interference mechanism by a type IIIB CRISPR-Cmr module in Sulfolobus». Molecular Microbiology 87 (5): 1088-1099. ISSN 1365-2958. PMID 23320564. doi:10.1111/mmi.12152. Consultado el 8 de agosto de 2016. 
  90. ↑ Marraffini, Luciano A.; Sontheimer, Erik J. (28 de enero de 2010). «Self versus non-self discrimination during CRISPR RNA-directed immunity». Nature 463 (7280): 568-571. ISSN 1476-4687. PMC 2813891. PMID 20072129. doi:10.1038/nature08703. Consultado el 8 de agosto de 2016. 
  91. Kellie, Shaefer (29 de mayo de 2017). «Unexpected mutations after CRISPR–Cas9 editing in vivo». Nature Methods. Consultado el 30 de julio de 2017. 
  92. Derek, Lowe (31 de mayo de 2017). «Trouble with CRISPR? Maybe, But Maybe Not». Science. Consultado el 30 de julio de 2017. 
  93. Whole-Genome Sequencing Analysis Reveals High Specificity of CRISPR/Cas9 and TALEN-Based Genome Editing in Human iPSCs. 
  94. Digenome-seq: genome-wide profiling of CRISPR-Cas9 off-target effects in human cells. 
  95. «Targeted and genome-wide sequencing reveal single nucleotide variations impacting specificity of Cas9 in human stem cells». 
  96. Suh, Yousin (14 de diciembre de 2017). «Faculty of 1000 evaluation for CIRCLE-seq: a highly sensitive in vitro screen for genome-wide CRISPR-Cas9 nuclease off-targets.». F1000 - Post-publication peer review of the biomedical literature. Consultado el 6 de enero de 2019. 
  97. Joung, J. Keith; Maresca, Marcello; Aryee, Martin J.; Bohlooly-Y, Mohammad; Pinello, Luca; Mayr, Lorenz M.; Nitsch, Roberto; Nguyen, Nhu T. et al. (2018-09). «In vivo CRISPR editing with no detectable genome-wide off-target mutations». Nature (en inglés) 561 (7723): 416-419. ISSN 1476-4687. PMC 6194229. PMID 30209390. doi:10.1038/s41586-018-0500-9. Consultado el 6 de enero de 2019. 
  98. Touchon, Marie; Rocha, Eduardo P. C. (1 de enero de 2010). «The small, slow and specialized CRISPR and anti-CRISPR of Escherichia and Salmonella». PloS One 5 (6): e11126. ISSN 1932-6203. PMC 2886076. PMID 20559554. doi:10.1371/journal.pone.0011126. Consultado el 8 de agosto de 2016. 
  99. ↑ Rho, Mina; Wu, Yu-Wei; Tang, Haixu; Doak, Thomas G.; Ye, Yuzhen (1 de enero de 2012). «Diverse CRISPRs evolving in human microbiomes». PLoS genetics 8 (6): e1002441. ISSN 1553-7404. PMC 3374615. PMID 22719260. doi:10.1371/journal.pgen.1002441. Consultado el 8 de agosto de 2016. 
  100. ↑ Sun, Christine L.; Barrangou, Rodolphe; Thomas, Brian C.; Horvath, Philippe; Fremaux, Christophe; Banfield, Jillian F. (1 de febrero de 2013). «Phage mutations in response to CRISPR diversification in a bacterial population». Environmental Microbiology 15 (2): 463-470. ISSN 1462-2920. PMID 23057534. doi:10.1111/j.1462-2920.2012.02879.x. Consultado el 8 de agosto de 2016. 
  101. Kuno, Sotaro; Sako, Yoshihiko; Yoshida, Takashi (1 de mayo de 2014). «Diversification of CRISPR within coexisting genotypes in a natural population of the bloom-forming cyanobacterium Microcystis aeruginosa». Microbiology (Reading, England) 160 (Pt 5): 903-916. ISSN 1465-2080. PMID 24586036. doi:10.1099/mic.0.073494-0. Consultado el 8 de agosto de 2016. 
  102. Bland, Charles; Ramsey, Teresa L.; Sabree, Fareedah; Lowe, Micheal; Brown, Kyndall; Kyrpides, Nikos C.; Hugenholtz, Philip (1 de enero de 2007). «CRISPR recognition tool (CRT): a tool for automatic detection of clustered regularly interspaced palindromic repeats». BMC bioinformatics 8: 209. ISSN 1471-2105. PMC 1924867. PMID 17577412. doi:10.1186/1471-2105-8-209. Consultado el 8 de agosto de 2016. 
  103. Edgar, Robert C. (1 de enero de 2007). «PILER-CR: fast and accurate identification of CRISPR repeats». BMC bioinformatics 8: 18. ISSN 1471-2105. PMC 1790904. PMID 17239253. doi:10.1186/1471-2105-8-18. Consultado el 8 de agosto de 2016. 
  104. Grissa, Ibtissem; Vergnaud, Gilles; Pourcel, Christine (1 de julio de 2007). «CRISPRFinder: a web tool to identify clustered regularly interspaced short palindromic repeats». Nucleic Acids Research 35 (Web Server issue): W52-57. ISSN 1362-4962. PMC 1933234. PMID 17537822. doi:10.1093/nar/gkm360. Consultado el 8 de agosto de 2016. 
  105. Pride, David T.; Salzman, Julia; Relman, David A. (1 de septiembre de 2012). «Comparisons of clustered regularly interspaced short palindromic repeats and viromes in human saliva reveal bacterial adaptations to salivary viruses». Environmental Microbiology 14 (9): 2564-2576. ISSN 1462-2920. PMC 3424356. PMID 22583485. doi:10.1111/j.1462-2920.2012.02775.x. Consultado el 8 de agosto de 2016. 
  106. Held, Nicole L.; Herrera, Alfa; Whitaker, Rachel J. (1 de noviembre de 2013). «Reassortment of CRISPR repeat-spacer loci in Sulfolobus islandicus». Environmental Microbiology 15 (11): 3065-3076. ISSN 1462-2920. PMID 23701169. doi:10.1111/1462-2920.12146. Consultado el 8 de agosto de 2016. 
  107. Held, Nicole L.; Herrera, Alfa; Cadillo-Quiroz, Hinsby; Whitaker, Rachel J. (1 de enero de 2010). «CRISPR associated diversity within a population of Sulfolobus islandicus». PloS One 5 (9). ISSN 1932-6203. PMC 2946923. PMID 20927396. doi:10.1371/journal.pone.0012988. Consultado el 8 de agosto de 2016. 
  108. Skennerton, Connor T.; Imelfort, Michael; Tyson, Gene W. (1 de mayo de 2013). «Crass: identification and reconstruction of CRISPR from unassembled metagenomic data». Nucleic Acids Research 41 (10): e105. ISSN 1362-4962. PMC 3664793. PMID 23511966. doi:10.1093/nar/gkt183. Consultado el 8 de agosto de 2016. 
  109. Koonin, Eugene V.; Wolf, Yuri I. (1 de enero de 2009). «Is evolution Darwinian or/and Lamarckian?». Biology Direct 4: 42. ISSN 1745-6150. PMC 2781790. PMID 19906303. doi:10.1186/1745-6150-4-42. Consultado el 8 de agosto de 2016. 
  110. Heidelberg, John F.; Nelson, William C.; Schoenfeld, Thomas; Bhaya, Devaki (1 de enero de 2009). «Germ warfare in a microbial mat community: CRISPRs provide insights into the co-evolution of host and viral genomes». PloS One 4 (1): e4169. ISSN 1932-6203. PMC 2612747. PMID 19132092. doi:10.1371/journal.pone.0004169. Consultado el 8 de agosto de 2016. 
  111. Sampson, Timothy R.; Saroj, Sunil D.; Llewellyn, Anna C.; Tzeng, Yih-Ling; Weiss, David S. (9 de mayo de 2013). «A CRISPR/Cas system mediates bacterial innate immune evasion and virulence». Nature 497 (7448): 254-257. ISSN 1476-4687. PMC 3651764. PMID 23584588. doi:10.1038/nature12048. Consultado el 8 de agosto de 2016. 
  112. Hale, Caryn R.; Majumdar, Sonali; Elmore, Joshua; Pfister, Neil; Compton, Mark; Olson, Sara; Resch, Alissa M.; Glover, Claiborne V. C.; Graveley, Brenton R.; Terns, Rebecca M.; Terns, Michael P. (10 de febrero de 2012). «Essential features and rational design of CRISPR RNAs that function with the Cas RAMP module complex to cleave RNAs». Molecular Cell 45 (3): 292-302. ISSN 1097-4164. PMC 3278580. PMID 22227116. doi:10.1016/j.molcel.2011.10.023. Consultado el 8 de agosto de 2016. 
  113. Sorek, Rotem; Kunin, Victor; Hugenholtz, Philip (1 de marzo de 2008). «CRISPR--a widespread system that provides acquired resistance against phages in bacteria and archaea». Nature Reviews. Microbiology 6 (3): 181-186. ISSN 1740-1534. PMID 18157154. doi:10.1038/nrmicro1793. Consultado el 8 de agosto de 2016. 
  114. Cong, Le; Ran, F. Ann; Cox, David; Lin, Shuailiang; Barretto, Robert; Habib, Naomi; Hsu, Patrick D.; Wu, Xuebing; Jiang, Wenyan; Marraffini, Luciano A.; Zhang, Feng (15 de febrero de 2013). «Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems». Science (New York, N.Y.) 339 (6121): 819-823. ISSN 1095-9203. PMC 3795411. PMID 23287718. doi:10.1126/science.1231143. Consultado el 8 de agosto de 2016. 
  115. Mali, Prashant; Yang, Luhan; Esvelt, Kevin M.; Aach, John; Guell, Marc; DiCarlo, James E.; Norville, Julie E.; Church, George M. (15 de febrero de 2013). «RNA-guided human genome engineering via Cas9». Science (New York, N.Y.) 339 (6121): 823-826. ISSN 1095-9203. PMC 3712628. PMID 23287722. doi:10.1126/science.1232033. Consultado el 8 de agosto de 2016. 
  116. Hou Z, Zhang Y, Propson N, Howden S, Chu L, Sontheimer E et al (2013). «Efficient genome engineering in human pluripotent stem cells using Cas9 from Neisseria meningitidis». Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 110 (39): 15644. doi:10.1073/pnas.1313587110. 
  117. ↑ Young, Susan. «Biotech Startup Editas Medicine Wants to Cure Grievous Genetic Diseases with New Genome Editing Technology | MIT Technology Review». Technologyreview.com. Consultado el 30 de noviembre de 2013. 
  118. «Seamless gene correction of β-thalassemia mutations in patient-specific iPSCs using CRISPR/Cas9 and piggyBac». 
  119. Eides, Rachel (12 de junio de 2020). «CRISPR Therapeutics and Vertex Announce New Clinical Data for Investigational Gene-Editing Therapy CTX001™ in Severe Hemoglobinopathies at the 25th Annual European Hematology Association (EHA) Congress». Consultado el 21 de junio de 2020. 
  120. Silva, Joana Cavaco (13 de mayo de 2020). «CTX001». Consultado el 24 de junio de 2020. 
  121. Talbot, David (19 de julio de 2014). «Beijing Researchers Use Gene Editing to Create Disease-Resistant Wheat | MIT Technology Review». Technologyreview.com. Consultado el 23 de julio de 2014. 
  122. Wang, Yanpeng (2014). «Simultaneous editing of three homoeoalleles in hexaploid bread wheat confers heritable resistance to powdery mildew». Nature Biotechnology. doi:10.1038/nbt.2969. 
  123. Chang, Jiasong, et al. "Genome-wide CRISPR Screening Reveals Genes Essential for Cell Viability and Resistance to Abiotic and Biotic Stresses in Bombyx Mori." Genome Research, vol. 30, no. 5, 2020, pp. 757-767.
  124. ENCODE Project Consortium (6 de septiembre de 2012). «An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome». Nature 489 (7414): 57-74. ISSN 1476-4687. PMC 3439153. PMID 22955616. doi:10.1038/nature11247. Consultado el 18 de febrero de 2017. 
  125. Melnikov, Alexandre; Murugan, Anand; Zhang, Xiaolan; Tesileanu, Tiberiu; Wang, Li; Rogov, Peter; Feizi, Soheil; Gnirke, Andreas et al.. «Systematic dissection and optimization of inducible enhancers in human cells using a massively parallel reporter assay». Nature Biotechnology 30 (3): 271-277. PMC 3297981. PMID 22371084. doi:10.1038/nbt.2137. 
  126. «Targeting the Noncoding Genome with CRISPR». 29 de septiembre de 2016. 
  127. Sanjana, Neville E.; Wright, Jason; Zheng, Kaijie; Shalem, Ophir; Fontanillas, Pierre; Joung, Julia; Cheng, Christine; Regev, Aviv et al. (30 de septiembre de 2016). «High-resolution interrogation of functional elements in the noncoding genome». Science (en inglés) 353 (6307): 1545-1549. ISSN 0036-8075. PMC 5144102. PMID 27708104. doi:10.1126/science.aaf7613. Consultado el 18 de febrero de 2017. 
  128. V600E
  129. Akbani, Rehan; Akdemir, Kadir C.; Aksoy, B. Arman; Albert, Monique; Ally, Adrian; Amin, Samirkumar B.; Arachchi, Harindra; Arora, Arshi et al.. «Genomic Classification of Cutaneous Melanoma». Cell 161 (7): 1681-1696. PMC 4580370. PMID 26091043. doi:10.1016/j.cell.2015.05.044. 
  130. Sosman, Jeffrey A.; Kim, Kevin B.; Schuchter, Lynn; Gonzalez, Rene; Pavlick, Anna C.; Weber, Jeffrey S.; McArthur, Grant A.; Hutson, Thomas E. et al. (23 de febrero de 2012). «Survival in BRAF V600–Mutant Advanced Melanoma Treated with Vemurafenib». New England Journal of Medicine 366 (8): 707-714. ISSN 0028-4793. PMC 3724515. PMID 22356324. doi:10.1056/NEJMoa1112302. Consultado el 18 de febrero de 2017. 
  131. Zubrilov, Inna; Sagi-Assif, Orit; Izraely, Sivan; Meshel, Tsipi; Ben-Menahem, Shlomit; Ginat, Ravit; Pasmanik-Chor, Metsada; Nahmias, Clara et al.. «Vemurafenib resistance selects for highly malignant brain and lung-metastasizing melanoma cells». Cancer Letters 361 (1): 86-96. doi:10.1016/j.canlet.2015.02.041. 
  132. Shalem, Ophir; Sanjana, Neville E.; Hartenian, Ella; Shi, Xi; Scott, David A.; Mikkelsen, Tarjei S.; Heckl, Dirk; Ebert, Benjamin L. et al. (3 de enero de 2014). «Genome-Scale CRISPR-Cas9 Knockout Screening in Human Cells». Science (en inglés) 343 (6166): 84-87. ISSN 0036-8075. PMC 4089965. PMID 24336571. doi:10.1126/science.1247005. Consultado el 18 de febrero de 2017. 
  133. Novick, Richard P.; Christie, Gail E.; Penadés, Jose R. (1 de agosto de 2010). «The phage-related chromosomal islands of Gram-positive bacteria». Nature Reviews. Microbiology 8 (8): 541-551. ISSN 1740-1534. PMC 3522866. PMID 20634809. doi:10.1038/nrmicro2393. Consultado el 8 de agosto de 2016. 
  134. Seed, Kimberley D.; Lazinski, David W.; Calderwood, Stephen B.; Camilli, Andrew (28 de febrero de 2013). «A bacteriophage encodes its own CRISPR/Cas adaptive response to evade host innate immunity». Nature 494 (7438): 489-491. ISSN 1476-4687. PMC 3587790. PMID 23446421. doi:10.1038/nature11927. Consultado el 8 de agosto de 2016. 
  135. «Who Owns the Biggest Biotech Discovery of the Century? There’s a bitter fight over the patents for CRISPR, a breakthrough new form of DNA editing.». MIT Technology Review. Consultado el 25 de febrero de 2015. «CRISPR Patents Spark Fight to Control Genome Editing». 
  136. «Methods And Compositions For Rna-directed Target Dna Modification And For Rna-directed Modulation Of Transcription». Freshpatents.com. Consultado el 13 de abril de 2014. 
  137. ↑ Who Owns the Biggest Biotech Discovery of the Century? Antonio Regalado, Technology Review, 04 December 2014.
  138. Pollack, Andrew (15 de febrero de 2017). «Harvard and M.I.T. Scientists Win Gene-Editing Patent Fight». The New York Times. 
  139. Akst, Jef (15 de febrero de 2017). «Broad Wins CRISPR Patent Interference Case». The Scientist Magazine. 
  140. Noonan, Kevin E. (16 de febrero de 2017). «PTAB Decides CRISPR Interference in Favor of Broad Institute -- Their Reasoning». Patent Docs. 
  141. «CRISPR Madness». GEN. 
  142. Staff (1 de abril de 2015). «News: Products & Services». Genetic Engineering & Biotechnology News (Paper) 35 (7): 8. 
  143. http://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(15)01705-5 The Heroes of CRISPR
  144. «http://www.agenciasinc.es/Entrevistas/Estoy-viviendo-la-revolucion-CRISPR-con-agobio-y-felicidad». Consultado el 5 de abril de 2017. 
  145. Alejandra Martins (2018). «CRISPR/Cas9: las serias advertencias de unos científicos sobre los peligros de la técnica que revolucionó la genética». 
  146. Jean-François Gariépy (2018). The revolutionary phenotype (en inglés). p. 92–95. ISBN 9781729861561. 
  •   Datos: Q412563
  •   Multimedia: CRISPR

Enero 26, 2022
crispr, inglés, clustered, regularly, interspaced, short, palindromic, repeats, español, repeticiones, palindrómicas, cortas, agrupadas, regularmente, interespaciadas, familias, secuencias, bacterias, secuencias, contienen, fragmentos, virus, atacado, bacteria. Los CRISPR en ingles clustered regularly interspaced short palindromic repeats en espanol repeticiones palindromicas cortas agrupadas y regularmente interespaciadas 2 son familias de secuencias de ADN en bacterias Las secuencias contienen fragmentos de ADN de virus que han atacado a las bacterias Estos fragmentos son utilizados por la bacteria para detectar y destruir el ADN de nuevos ataques de virus similares y asi poder defenderse eficazmente de ellos Estas secuencias juegan un papel clave en los sistemas de defensa bacterianos y forman la base de una tecnologia conocida como CRISPR Cas9 que efectiva y especificamente cambia los genes dentro de los organismos En terminos mas tecnicos son loci de ADN que contienen repeticiones cortas de secuencias de bases Tras cada repeticion siguen segmentos cortos de ADN espaciador proveniente de exposiciones previas a un virus 3 Se encuentran en aproximadamente el 40 de los genomas bacterianos y en el 90 de los genomas secuenciados de las arqueas 4 5 Con frecuencia se hallan asociados con los genes cas que codifican para proteinas nucleasas relacionadas con los CRISPR El sistema CRISPR Cas es un sistema inmunitario procariotico que confiere resistencia a agentes externos como plasmidos y fagos 6 7 y provee una forma de inmunidad adquirida Los espaciadores de los CRISPR reconocen secuencias especificas y guian a las nucleasas cas para cortar y degradar esos elementos genicos exogenos de una manera analoga al ARNi en sistemas eucarioticos 3 CRISPRCRISPR fragmentos de ADN de E Coli IdentificadoresOrganismo E ColiSimbolo Otros datos Diagrama del posible mecanismo de los CRISPR 1 Desde 2013 el sistema CRISPR Cas se ha utilizado para la edicion de genes agregando interrumpiendo o cambiando las secuencias de genes especificos y para la regulacion genica en varias especies 8 Al administrar la proteina Cas9 y los ARN guia apropiados a una celula el genoma de esta puede cortarse en los lugares deseados cuyas secuencias seran complementarias a las de los ARN guia utilizados Esto permite la eliminacion funcional de genes o la introduccion de mutaciones tras la reparacion del corte realizado por la maquinaria celular de reparacion del ADN para estudiar sus efectos Modificaciones recientes del sistema CRISPR Cas9 permiten tambien actuar sobre la transcripcion de los genes modificando asi solo su nivel de funcionamiento pero no la informacion genetica Quiza puedan usarse los CRISPRs para construir sistemas de entrega de genes guiados por ARN que lleguen a alterar los genomas de poblaciones enteras 9 Indice 1 Antecedentes 1 1 Cas9 1 2 Cas12a anteriormente Cpf1 1 3 CasF 1 4 Predecesores para edicion genica 1 5 Primera edicion genica comunicada en julio de 2017 2 Estructura del locus 2 1 Repeticiones y espaciadores 2 2 Genes cas y subtipos de CRISPR 3 Mecanismo 3 1 Adquisicion de los espaciadores dentro de los loci de los CRISPR 3 2 Etapa de interferencia 4 Mutaciones aleatorias 5 Evolucion diversidad 6 Identificacion bioinformatica de los CRISPR en genomas y metagenomas 7 Importancia evolutiva 8 Aplicaciones 8 1 Terapias 8 2 Modelos murinos 8 3 Agricultura 8 4 Entomologia 8 5 Identificacion de elementos funcionales en regiones genomicas no codificantes 8 6 En reproduccion humana 9 Funciones 9 1 Edicion 9 2 Knockout reversible 9 3 Activacion 9 4 Uso por fagos 10 Automatizacion y soporte de librerias 11 Propiedad intelectual 12 Cortadores alternativos 13 Riesgos 14 Vease tambien 15 ReferenciasAntecedentes EditarLas bacterias pueden incorporar ADN externo en otras circunstancias e incluso pueden tomar ADN danado de su medio 10 Las secuencias repetidas que luego se conocerian como CRISPR fueron identificadas por primera vez por un grupo de cientificos japoneses en 1987 Yoshizumi Ishino et al 11 12 y luego mas tarde de forma independiente por el cientifico Francisco J M Mojica Universidad de Alicante a principios de los anos 90 en una arquea Haloferax mediterranei y los resultados fueron publicados en 1993 13 tras haber sido anteriormente descritas en bacterias Escherichia coli 12 y Mycobacterium bovis 14 Inicialmente fueron utilizadas para el tipado de bacterias para diferenciar distintos aislados cepas y especies 15 Estudios iniciales por Francisco J M Mojica y colaboradores postularon el posible papel de estas secuencias en la particion de replicones 16 En el ano 2000 Francisco J M Mojica y colaboradores detectaron un gran numero de estas secuencias repetidas en bacterias arqueas y mitocondrias y propusieron el nombre de Short Regularly Spaced Repeats SRSR en castellano Repeticiones Cortas Regularmente Espaciadas 17 Pocos anos despues Francisco J M Mojica propuso y acuno el acronimo CRISPR del ingles Clustered Regularly Interspaced Short Palyndromic Repeats propuesta que quedo recogida en una publicacion de microbiologos holandeses en 2002 18 y que seria utilizada universalmente desde entonces para referirse a estas secuencias Tambien en la misma publicacion se describio por vez primera un conjunto de genes algunos de los cuales codifican nucleasas o helicasas putativas asociados a las secuencias repetidas CRISPR los genes cas o asociados a CRISPR del ingles CRISPR associated 18 Diagrama simplificado de un locus CRISPR donde se muestran sus tres componentes mayoritarios los genes cas una secuencia lider y un arreglo de repeticiones espaciadores las repeticiones se muestran como cajas grises y los espaciadores son las barras de color El arreglo de esos tres componentes no siempre es como se muestra 1 3 Ademas en el mismo genoma pueden presentarse varios CRISPRs con un DR similar de los cuales solo uno este asociado con los genes cas 5 En 2005 tres grupos de investigacion independientes mostraron que algunos de los espaciadores de los CRISPRs se derivan de diversas fuentes de ADN como ADN de fagos y ADN extracromosomal como los plasmidos 19 20 Nuevamente fue el grupo de Francisco J Mojica quien primero se dio cuenta de que las secuencias CRISPR y los espaciadores asociados podian formar parte de algun sistema inmune propio de estos microorganismos procarioticos quien primero establecio la relacion entre CRISPR e inmunidad 21 Esas observaciones clave indican que el sistema CRISPR cas puede tener un rol en la inmunidad adaptativa en las bacterias 1 Koonin y sus asociados 22 propusieron que los espaciadores sirven como plantilla para moleculas de ARN analogo a un sistema que usan los eucariontes llamado interferencia por ARN En 2007 Barrangou Horvath cientificos de la industria alimenticia en Danisco y el grupo de Moineau en la Universite Laval Canada mostraron que podian alterar la resistencia de Streptococcus thermophilus a ataques de fagos con ADN espaciador 22 Cas9 Editar Jennifer Doudna y Emmanuelle Charpentier ganadoras del Premio Nobel de Quimica 2020 junto con Francisco Juan Martinez Mojica habian estado explorando de manera independiente a las proteinas asociadas a CRISPR para aprender como las bacterias utilizan a los espaciadores en sus sistemas inmunes Juntas estudiaron un sistema CRISPR mas simple que se basa en una proteina llamada Cas9 Encontraron que las bacterias responden ante un fago invasor al transcribir espaciadores y ADN palindromico en una larga molecula de ARN y que entonces la celula utilizaba un ARN llamado Trans activating crRNA tracrRNA y tambien Cas9 para cortarla en pedazos llamados ARNcr 22 Cas9 es una nucleasa una enzima especializada en cortar ADN con dos sitios de corte activos HNH y RuvC uno para cada hebra de la doble helice El equipo demostro que podrian desactivar uno o ambos sitios preservando la habilidad de Cas9 de ser especifico para su ADN objetivo Jinek combino al tracrRNA y ARN espaciador para formar una molecula llamada single guide RNA que al combinarse con Cas9 podia encontrar y cortar los blancos correctos de ADN Jinek propuso que estos ARN guia sinteticos podrian usarse para la edicion de genes 22 La primera vez que se mostro que CRISPR funcionaba como una herramienta de ingenieria genetica en cultivos de celulas humanas fue en 2012 23 24 Desde entonces se ha utilizado en muchos organismos incluida la levadura del pan Saccharomyces cerevisiae 25 el pez cebra Danio rerio 26 la mosca de la fruta Drosophila melanogaster 27 nematodos Caenorhabditis elegans 28 plantas 29 y ratones 30 entre otros Adicionalmente CRISPR ha sido modificada para hacer factores de transcripcion programables que permiten a los cientificos silenciar o activar ciertos genes 31 Existen ahora librerias con decenas de miles de ARN guia 22 La primera evidencia de que CRISPR puede revertir sintomas de enfermedad en organismos vivos fue demostrada en marzo de 2014 cuando investigadores del MIT curaron a ratones de desordenes geneticos del higado 32 Cas12a anteriormente Cpf1 Editar En 2015 la nucleasa Cpf1 se descubrio en el sistema CRISPR Cpf1 de la bacteria Francisella novicida 33 34 Cpf1 mostro varias diferencias claves de Cas9 incluyendo causando un corte escalonado en el ADN de doble hebra en oposicion al corte brusco producido por Cas9 basandose en un PAM rico en T proporcionando sitios de orientacion alternativos a Cas9 y requiriendo solamente Un CRISPR ARN CRRNA para el exito de la orientacion Por el contrario Cas9 requiere tanto crARN y un crARN trans activado tracrRNA Actualmente esta nucleasa recibe el nombre de Cas12a y presenta algunas variantes en funcion del organismo de origen entre las que se encuentran AsCas12a presente en la bacteria Acidaminococcus y LbCas12a presente en Lachnospiraceae bacterium Ademas en esta ultima variante se descubrio una mutacion puntual D156R que representa la sustitucion del aminoacido acido aspartico por arginina en la posicion 156 de la proteina Cas12aD156R muestra un aumento en la eficiencia de corte en el modelo vegetal Arabidopsis thaliana similar al que despues se corroboro en D melanogaster generando una eficiencia en la tasa de edicion genica proxima a la observada en Cas9 35 CasF Editar Se trata de una nucleasa hipercompacta descrita en 2020 que representa la mitad del peso molecular de Cas9 Cas12 y con caracteristicas similares en su utilizacion como herramienta para la edicion genica 36 Ademas se ha adaptado de forma exitosa a la edicion in vivo en Drosophila melanogaster de forma precisa sin generar cortes en el ADN de doble cadena 37 Predecesores para edicion genica Editar Al inicio de la decada de los 2000 investigadores desarrollaron las nucleasas con dedos de zinc proteinas sinteticas cuyas regiones de union a ADN les permitian cortar el ADN en puntos especificos Despues las nucleasas sinteticas llamadas TALENs dieron una via mas sencilla para llegar a ADN especifico y se predijo que sobrepasarian a las de los dedos de zinc Ambas dependen de la elaboracion de proteinas especificas para cada ADN objetivo un procedimiento bastante mas complicado que los ARN guia Los CRISPRs son mas eficientes y pueden llegar a mas genes que ambas tecnicas 38 Primera edicion genica comunicada en julio de 2017 Editar El 12 de julio de 2017 la revista britanica Nature comunico un trabajo recibido el 22 de agosto de 2016 comunicando que investigadores de la Universidad de Harvard modificaron en el genoma de un grupo de bacterias por medio de corta pega o copipasteo genetico logrado con la tecnica CRISPR la informacion digital de una fotografia y un GIF o animacion corta Despues secuenciaron el ADN de los microorganismos para recuperar la imagen y el video con una precision del 90 39 El avance atrajo nuevo interes cientifico en el campo de la grabacion molecular y en particular conjeturas al parecer prematuras e inexactas sobre la memorizacion en sistemas accedidos desde un psiquismo Estructura del locus EditarRepeticiones y espaciadores Editar Los loci de CRISPR van de 24 a 48 pares de bases 40 Las repeticiones estan separadas por espaciadores de longitud similar 40 Algunas secuencias espaciadoras de CRISPR son complementarias a las de los plasmidos y fagos 19 21 20 aunque algunos espaciadores se complementan con el genoma procarionte espaciadores autoreplicativos 19 41 Pueden anadirse rapidamente espaciadores nuevos como respuesta a una infeccion por un fago 42 Genes cas y subtipos de CRISPR Editar Los genes asociados a CRISPR llamados cas son genes frecuentemente relacionados con los arreglos de repeticiones CRISPR Analisis extensivos de genomica comparativa han identificado a muchos genes cas diferentes un analisis inicial de 40 genomas de bacterias y arqueas sugirio que podria haber 45 familias de genes cas con solo dos genes cas1 y cas2 siendo omnipresentes 40 El sistema actual de clasificacion de CRISPR agrupa a los operones en cas en tres grupos mayores cada uno con multiples subdivisiones basadas en filogenia de cas1 y en el complemento del operon del gen cas 43 Aparte de cas1 y cas2 las tres divisiones mayores tienen conjuntos muy diferentes de genes constitutivos con cada una de las divisiones conteniendo un gen caracteristico encontrado exclusivamente en esa subdivision Muchos organismos contienen multiples sistemas CRISPR Cas sugiriendo que son compatibles e incluso podrian compartir elementos 44 La distribucion esporadica de los subtipos de CRISPR Cas sugiere que el sistema esta sujeto a la transferencia genetica horizontal durante la evolucion microbiana Genes caracteristicos y sus funciones putativas para los tipos mayores y menores de CRISPR Cas Tipo Cas Gen caracteristico Funcion ReferenciaI Cas3 Nucleasa para ADN de cadena sencilla Helicasa dependiente de ATP 45 IA Cas8a Subunidad del modulo de interferencia 46 IB Cas8bIC Cas8cID Cas10d Contiene un dominio homologo al dominio de las polimerasas de acidos nucleicos y ciclasas de nucleotidos 43 47 IE Cse1IF Csy1 IndeterminadoII Cas9 Las nucleasas RuvC and HNH juntas producen cortes en cadena doble y de manera separada pueden producir cortes en cadena sencilla 48 IIA Csn2 IndeterminadoIIB Cas4 IndeterminadoIIC Caracterizado por la ausencia ya sea de Csn2 o Cas4 49 III Cas10 Homologo de Cas10d y Cse1 47 IIIA Csm2 IndeterminadoIIIB Cmr5 IndeterminadoMecanismo Editar Las etapas de inmunidad CRISPR por cada uno de los tres tipos mayores de inmunidad adaptativa 1 Comienza la adquisicion por el reconocimiento de ADN invasor por Cas1 and Cas2 y hay corte de un protoespaciador 2 El protoespaciador se liga a repetidos directos adyacentes a la secuencia lider y 3 la extension de cadena sencilla repara el CRISPR y duplica el repetido directo El procesado e interferencia de ARNcr ocurren diferentemente en cada uno de los tres sistemas mayores de CRISPR 4 El transcrito primario de CRISPR es cortado por los genes cas para producir ARNcr 5 En sistemas tipo I Cas6e Cas6f cortan en la union de ARN de cadena sencilla y ARN de cadena doble formada por vueltas tipo hairpin en el repetido directo Los sistemas tipo II usan un ARN trans activador tracr para formar ARN de cadena doble el cual es cortado por Cas9 y la RNasaIII Los sistemas tipo II usan un homologo de Cas 6 que no requiere vueltas tipo hairpin en los repetidos directos para efectuar el corte 6 En los sistema II y III se hace un recorte secundario ya sea en el extremo 5 o 3 para producir ARNcr maduros 7 Los ARNcr maduros se asocian con las proteinas cas para formar complejos de interferencia 8 En sistemas tipo I y II el apareamiento de bases entre el ARNcr y el PAM provoca la degradacion del ADN invasor En el tipo III los sistemas no requieren PAM para la degradacion exitosa y en los sistemas tipo III A el apareamiento de bases ocurre entre ARNcr y ARNm en vez de con ADN dirigido por los sistemas tipo III B Adquisicion de los espaciadores dentro de los loci de los CRISPR Editar Capturar al ADN invasor e integrarlo en un locus CRISPR en forma de un espaciador es la primera etapa en la respuesta inmune La prevalencia de cas1 y cas2 fue la primera pista de que estaban involucrados en la adquisicion de los espaciadores ya que todos los CRISPRs comparten la estructura repetitiva regular Estudios de mutaciones confirmaron esta hipotesis ya que al remover cas1 o cas2 impedia la adquisicion de espaciadores sin afectar la respuesta inmune CRISPR en si 46 50 51 52 53 La funcion exacta de Cas1 y Cas2 se desconoce sin embargo un numero de proteinas Cas1 se han caracterizado bioquimicamente y se han resuelto sus estructuras 54 55 56 Las proteinas Cas1 tienen secuencias de aminoacidos muy diversas sin embargo sus estructuras cristalinas son sorprendentemente similares y todas las cas1 purificadas son nucleasas dependientes de metales que se unen a ADN en modo independiente de secuencia 44 Las proteinas Cas2 representativas tambien han sido caracterizadas y poseen actividad especifica de endorribonucleasa ya sea para ARN de cadena sencilla o ADN de cadena doble 57 58 59 Los datos funcionales y estudios de mutacion genetica sugieren que Cas1 y Cas2 cortan fragmentos de ADN invasor y los insertan en arreglos CRISPR El analisis bioinformatico de regiones de genomas de fagos que fueron cortados como espaciadores denominados protoespaciadores revelo que estos no estaban distribuidos aleatoriamente sino mas bien se encontraban adyacentes a secuencias cortas de ADN de 3 a 5 pb llamadas PAMs protospacer adjacent motifs en ingles 60 El analisis de los sistemas CRISPR Cas de las tres divisiones mayores han mostrado que los PAMs son importantes para los sistemas tipo I y II pero no para el III durante el proceso de adquisicion de espaciadores 20 61 62 60 63 64 En sistemas tipo I y II los protoespaciadores se cortan en posiciones adyacentes a una secuencia PAM con el otro extremo del espaciador siendo cortado con un mecanismo tipo regla inherente a la proteina Cas1 manteniendo asi la regularidad en tamano de los espaciadores a lo largo del arreglo de CRISPR 65 66 La conservacion de la secuencia PAM difiere entre los sistemas CRISPR Cas y parece estar ligada evolutivamente a cas1 y a la secuencia lider 64 67 Los nuevos espaciadores se anaden a un arreglo de CRISPR en un modo direccional 19 ocurriendo preferencialmente 61 62 68 42 69 pero no exclusivamente en forma adyacente 63 66 a la secuencia lider El analisis del sistema tipo I E de E coli ha demostrado que la primera repeticion directa adyacente a la secuencia lider es copiado con el espaciador recientemente adquirido siendo insertado entre la primera y segunda repeticiones directas 52 65 La secuencia PAM tambien parece ser importante durante la insercion de espaciadores den sistemas tipo I E La secuencia PAM del sistema I E contiene un nucleotido final fuertemente conservado adyacente al primer nucleotido del protoespaciador y se ha mostrado que este nucleotido se convierte en la base final en la primera repeticion directa 53 70 71 Esto sugiere que la maquinaria de adquisicion de espaciadores genera overhangs de cadena sencilla en la penultima posicion de la repeticion directay en el PAM durante la insercion del espaciador Sin embargo no todos los sistemas CRISPR Cas parecen tener este mecanismo ya que los PAMs caracterizados en otros organismos no muestran el mismo nivel de conservacion en la posicion final 67 Es probable que en esos sistemas un extremo romo es generado al final de la repeticion directa y el protoespaciador durante la adquisicion Analisis reciente de CRISPRs de Sulfolobus solfataricus han revelado mas complejidades al modelo canonico de la insercion de espaciadores ya que uno de sus seis locus inserto espaciadores de manera aleatoria a lo largo de su arreglo CRISPR opuesto a una insercion mas cercana a la secuencia lider 66 Ha sido notado en una cantidad de CRISPRs que estos contienen muchos espaciadores para el mismo fago El mecanismo que causa este fenomeno ha sido dilucidado recientemente en el sistema tipo I E de E coli Una mejora significativa en la adquisicion de espaciadores ha sido detectada donde ya hay espaciadores con el fago como objetivo inclusive con desajustes al protoespaciador Este cebado requiere que tanto las proteinas Cas involucradas en adquisicion como en interferencia interactuen entre si Los espaciadores nuevamente adquiridos que resultan del mecanismo de cebado siempre se encuentran en la misma cadena que la del espaciador original que produjo el cebado 53 70 71 Esta observacion ha llevado a la hipotesis de que la maquinaria de adquisicion recorre el ADN extrano despues del cebado para encontrar un nuevo protoespaciador 71 Etapa de interferencia Editar La respuesta inmune por CRISPR ocurre en dos etapas la biogenesis de CRISPR ARN ARNcr y la interferencia guiada por ARNcr Un arreglo de CRISPR es transcrito de un promotor en el lider en un solo transcrito largo 46 72 73 Este transcrito es procesado por cortes dentro de las secuencias repetidas para formar ARNcr Los mecanismos para producir ARNcr maduros varian de gran manera entre los tres sistemas principales de CRISPR Cas Tanto en sistemas del tipo I E como I F las proteinas Cas6e y Cas6f respectivamente reconocen giros 74 75 76 creados por la naturaleza palindromica de las repeticiones directas 77 Esas proteinas cortan el transcrito primario en la union entre los ARN de cadena sencilla y doble dejando un extremo 5ʹ de 8 nucleotidos originado de la repeticion en los ARNcr maduros y con una secuencia espaciadora Los sistemas tipo III tambien usan Cas6 sin embargo sus repeticiones no producen girosstem loops sino que la escision ocurre por el enroscamiento del transcrito primario a lo largo de la Cas6 para permitir la division justo antes de la secuencia de repeticion 78 79 80 Los sistemas tipo II no poseen el gen Cas6 asi que utilizan a la ARNsaIII para hacer los cortes Los sistemas funcionales tipo II codifican un pequeno ARN adicional que es complementario a la secuencia de las repeticiones conocido como ARN trans activador tracrRNA 50 La transcripcion del tracrRNA y del transcrito primario CRISPR resulta en emparejamiento de bases y la formacion de ARN de doble cadena en la secuencia de repeticiones la cual es subsecuentemente cortada por la ARNasaIII para producir ARNcr A diferencia de los otros dos sistemas el ARNcr no contiene el espaciador completo esta truncado en un extremo por diez nucleotidos 48 Los ARNcr se asocian con las proteinas Cas para formar complejos de ribonucleotidos que reconocen acidos nucleicos extranos Experimentos con fagos y plasmidos han indicado que los ARNcr no tienen preferencia por cadenas codificantes o no codificantes lo cual indica un sistema especifico para ADN guiado por ARN 7 46 53 81 82 83 84 El complejo tipo I E llamado Cascade de forma comun requiere cinco proteinas Cas arregladas en una configuracion que recuerda a un caballo de mar unidas al ARNcr de cadena sencilla que esta unido a lo largo del lomo 85 86 Durante el estado de interferencia en los sistemas tipo I la secuencia PAM es reconocida en la cadena complementaria al ARNcr y se requiere junto con el apareamiento de ARNcr En los sistemas tipo I el correcto emparejamiento entre el ARNcr y los protoespaciadores senaliza un cambio conformacional en Cascade que recluta a Cas3 para la degradacion del ADN Los sistemas de tipo II utilizan una proteina multifuncional Cas9 para el paso de interferencia 48 La Cas9 requiere tanto al ARNcr como al tracrRNA para funcionar y corta al ADN usando sus dominios duales de endonucleasa HNH y RuvC El apareamiento de bases entre el PAM y el genoma del fago tambien se requiere en los sistemas tipo II sin embargo el PAM es reconocido en la misma cadena que el ARNcr la cadena opuesta a los sistemas tipo I Los sistemas tipo III como los de tipo I requieren un complejo multiproteico para asociarse con el ARNcr Analisis bioquimicos y estructurales de S solfataricus y Pyrococcus furiosus han dilucidado que seis o siete proteinas cas se unen a los ARNcr respectivamente 87 88 Sorpredentemente los sistemas tipo III analizados en S solfataricus y P furiosus son especificos para el ARNm de fagos y plasmidos 89 88 lo cual puede hacer a esos sistemas capaces de ser especificos para genomas de fagos basados en ARN 44 El mecanismo para distinguir ADN propio del externo durante la interferencia esta dentro de los ARNcr y por lo tanto se infiere que es conservado en los 3 sistemas Aun a traves del proceso de maduracion distintiva de cada uno de los tipos todos los ARNcr contienen una secuencia espaciadora y una porcion de la repeticion en uno o ambos extremos Es la secuencia parcial de repeticiones la que previene que el sistema CRISPR Cas ataque al cromosoma ya que el apareamiento de bases mas alla de la secuencia del espaciador es una senal de que pertenece a si mismo y previene el corte de ADN en el cromosoma 90 Las enzimas de CRISPR guiadas por ARN se clasifican como enzimas de restriccion tipo V Proteina asociada a CRISPR Estructura cristalina de una proteina asociada a CRISPR de Thermus thermophilusIdentificadoresSimboloCRISPR assocPfamPF08798clanPfamCL0362InterProIPR010179CDDcd09727Estructuras disponibles Pfamhttps web archive org web 20130526092118 http pfam sanger ac uk family PF08798 tab pdbBlockPDBRCSB PDB PDBe PDBjPDBsumresumen de estructurasProteina asociada a CRISPR Cas2 Estructura cristalina de la proteina hipotetica tt1823 de Thermus thermophilusIdentificadoresSimboloCRISPR Cas2PfamPF09827InterProIPR019199CDDcd09638Estructuras disponibles Pfamhttps web archive org web 20130526102839 http pfam sanger ac uk family PF09827 tab pdbBlockPDBRCSB PDB PDBe PDBjPDBsumresumen de estructurasProteina asociada a CRISPR Cse1IdentificadoresSymbolCRISPR Cse1PfamPF09481InterProIPR013381CDDcd09729Estructuras disponibles Pfamhttps web archive org web 20130526090632 http pfam sanger ac uk family PF09481 tab pdbBlockPDBRCSB PDB PDBe PDBjPDBsumresumen de estructurasProteina asociada a CRISPR Cse2IdentificadoresSimboloCRISPR Cse2PfamPF09485InterProIPR013382CDDcd09670Estructuras disponibles Pfamhttps web archive org web 20130526083954 http pfam sanger ac uk family PF09485 tab pdbBlockPDBRCSB PDB PDBe PDBjPDBsumresumen de estructurasMutaciones aleatorias EditarEn 2017 se demostro en un estudio 91 que este tipo de ingenieria genetica puede generar centenares de mutaciones aleatorias no esperadas Dos dias despues de esta publicacion la reconocida revista Science publica un articulo que pone en entredicho la veracidad de este estudio critico 92 Diferentes estudios anteriores muestran un alto nivel de especificidad de CRISPR 93 94 95 Para la comprobacion de estas mutaciones aleatorias o fuera de la region diana off targets en ingles de las guias disenadas han surgido herramientas de estudio de estas regiones de una forma automatizada como la herramienta VIVO 96 97 VIVO es un sistema de deteccion in vivo de off targets Esta herramienta es un metodo eficiente para la deteccion de las zonas de edicion fuera de la region diana a la cual orientamos las guias RNA del sistema de edicion genomica CRISPR Cas Actualmente es el unico metodo que cuenta con una observacion inicialmente in vitro de los posibles off targets de las guias con una posterior comprobacion in vivo de la accion real de las guias RNA El sistema VIVO nos permite detectar y cuantificar las regiones fuera de la diana o target de las nucleasas de esta forma se busca definir que generando una guia RNA bien disenada esta carece de off targets o mutaciones aleatorias El sistema VIVO se compone de dos etapas consecutivas a CIRCLEseq es un metodo in vitro para la determinacion de los posibles off targets que puede generar una RNA guia en unas celulas determinadas Esta etapa se basa en la localizacion de regiones del DNA donde pueda producir un corte la Cas9 debido a que estas regiones son complementarias a los RNA guias disenados Esas regiones del DNA se cortan y se anillan dando lugar a fragmentos circulares de DNA con regiones para el corte mediado por Cas9 y otras sin region reconocida por la Cas9 que se van a degradar mediante un tratamiento con exonucleasas Los fragmentos circulares deseados se someten a una linealizacion mediante el uso de la Cas9 Los fragmentos lineales adquieren un ligando adaptador se someten a PCR y posteriormente se analizan mediante tecnicas de secuenciacion Cada una de las secuencias obtenidas correspondera a un posible off target de la Cas9 mediante el uso de las guias disenadas b Comprobacion in vivo a partir de los datos obtenidos mediante CIRLCE seq se comprueba que realmente se produce un corte en esas regiones del DNA mediante la Cas9 in vivo Para ello se utiliza un tejido al que se aplica las Cas9 y se observa si las regiones predichas por CIRCLE seq realmente se cortan por las nucleasas Evolucion diversidad EditarEstudios en Streptococcus thermophilus fueron los primeros indicativos de como los CRISPRs mueven a la evolucion de fagos y bacterias Un espaciador CRISPR debe corresponder perfectamente a la secuencia del gen objetivo del fago Los fagos pueden seguir infectando a sus hospederos cuando hay mutaciones puntuales en el espaciador 90 Se siguen requerimientos similares en el PAM o la cepa seguira siendo sensible a fagos 62 90 El modelo basico de evolucion CRISPR se explica como el modelo donde los espaciadores recientemente incorporados llevan a los fagos a mutar sus genomas creando diversidad en las poblaciones tanto de fagos y bacterias La evolucion CRISPR ha sido estudiada usando la genomica comparativa de muchas cepas de S thermophilus Escherichia coli y Salmonella enterica Un estudio de 124 cepas de S thermophilus mostro que 26 de todos los espaciadores eran unicos y que los diferentes locus de CRISPR mostraban diferentes tasas de adquisicion de espaciadores 61 Los resultados mostraron que un locus de CRISPR particular puede evolucionar mas rapidamente que otros lo cual ayuda a establecer relaciones filogeneticas entre cepas Un analisis similar de cepas de E coli y S enterica revelo que evolucionaron mucho mas lentamente que S thermophilus Las cepas de esta ultima que habian divergido hace mas de 250 000 anos todavia contenian el mismo complemento de espaciador 98 La diversidad de CRISPR se estudio en multiples comunidades ambientales usando metagenomica El analisis de los biofilms de los drenajes acidos de dos minas mostro que uno de los CRISPRs analizados contenia deleciones y espaciadores extensivos en comparacion con el otro biofilm lo cual sugiere una mayor actividad de fagos en una comunidad que en otra 42 En la cavidad oral un estudio temporal determino que aproximadamente del 7 al 22 de los espaciadores eran compartidos en periodos en el tiempo a lo largo de 17 meses en un mismo individuo y menos del 2 de los espaciadores fueron compartidos entre diferentes individuos en cualquier periodo en el tiempo 69 Del mismo ambiente se aislo una cepa particular usando primers de PCR especificos para su CRISPR A diferencia de los resultados generales de la presencia ausencia de los espaciadores los cuales mostraban diversidad significativa este CRISPR anadio 3 espaciadores a lo largo de 17 meses 69 lo que sugiere que incluso en un ambiente con diversidad importante de CRISPR algunos locus evolucionan lentamente Los CRISPRs tambien han sido analizados desde los metagenomas producidos por el proyecto del microbioma humano 99 Aunque la mayoria de los CRISPRs eran especificos en un sitio algunos CRISPRs dentro del sitio eran ampliamente encontrados entre individuos Uno de esos locus de CRISPR se origino con estudios de especies de Streptococcus y contuvieron 15 000 espaciadores 50 de los cuales eran unicos De modo similar a los estudios dirigidos de la cavidad oral algunos de los CRISPRs mostraron poca evolucion entre periodos en el tiempo 99 La evolucion CRISPR ha sido estudiada en quimiostatos usando S thermophilus para examinar de manera explicita la tasa de adquisicion de espaciadores En el periodo de una semana cepas de S thermophilus adquirieron hasta tres espaciadores cuando eran expuestos ante solo un fago 100 En el mismo periodo de tiempo el fago desarrollo varios SNPs que se quedaron fijos es la poblacion lo que sugiere que CRISPR habia prevenido la replicacion de todos los otros tipos de fagos sin estas mutaciones 100 Otros experimentos tambien con S thermophilus mostraron que los fagos pueden infectar y replicarse en hospederos que tienen solo un espaciador y que los hospederos sensibles existen en ambientes con altas concentraciones de fagos 101 Los estudios por quimiostatos y observaciones en los CRISPRs sugieren muchas consecuencias al resultado de la evolucion de CRISPR y fagos Identificacion bioinformatica de los CRISPR en genomas y metagenomas EditarLos CRISPRs estan altamente distribuidos entre bacterias y arqueas 43 y muestran similitudes en las secuencias 77 sin embargo su caracteristica principal son sus espaciadores repetidos y repeticiones directas Esta caracteristica hace a los CRISPRs faciles de identificar en largas secuencias de ADN ya que el numero de copias repetidas disminuye la posibilidad de una union tipo falso positivo En la actualidad hay tres programas utilizados para la identificacion de repeticiones CRISPR que buscan repeticiones interespaciadas en secuencias grandes CRT 102 PILER CR 103 y CRISPRfinder 104 El analisis de los CRISPRs en los datos de metagenomica es mucho mas demandante ya que los locus de CRISPR no suelen ensamblarse debido a su naturaleza repetitiva ni por variacion de cepas lo cual confunde a los algoritmos Mientras que hay muchos genomas de referencias disponibles la PCR se puede utilizar para amplificar arreglos de CRISPR y asi analizar el contenido de los espaciadores 61 69 105 106 107 Sin embargo este enfoque solamente dara informacion de CRISPRs especificamente buscados y en organismos con suficiente representacion en bases de datos publicas para poder hacer el diseno de primers de PCR confiables El enfoque alterativo es extraer y reconstruir los arreglos de CRISPR arrays basandose en datos shotgun metagenomicos La identificacion de los arreglos de CRISPR de lecturas metagenomias es una tarea computacionalmente mas dificil particularmente con las tecnologias de secuenciacion de segunda generacion como son 454 Illumina ya que las longitudes cortas previenen que mas de dos o tres unidades repetidas se presenten en una sola lectura La identificacion de CRISPR en lecturas crudas se logra usando puramente identificacion denovo 108 o al usar secuencias repetidas directas en arreglos CRISPR parcialmente ordenados 99 como herramienta para identificar repeticiones directos en lecturas individuales Importancia evolutiva EditarUn estudio bioinformatico mostro que los CRISPRs son evolutivamente conservados y que se pueden aglomerar en tipos relacionados Muchos muestran la posibilidad de una estructura secundaria conservada 77 A traves del mecanismo CRISPR Cas las bacterias pueden adquirir inmunidad a ciertos fagos y por ende detener la consecuente transmision de estos fagos Por esta razon los CRISPR Cas se describen como un mecanismo de herencia Lamarckiano 109 Otros han investigado la coevolucion de los genomas vitales y hospederos 110 Las proteinas Cas9 estan altamente enriquecidas en bacterias patogenicas y comensales La regulacion mediada por CRISPR Cas puede contribuir a la regulacion de los genes endogenos bacterianos particularmente en la interaccion bacteriana con hospederos eucariontes Por ejemplo la proteina Cas9 de Francisella novicida usa un pequeno y unico ARN asociado a CRISPR Cas para reprimir un transcrito endogeno que codifica para una lipoproteina bacteriana que es critica para F novicida para reducir la respuesta del hospedero y promover la virulencia 111 Aplicaciones EditarLa prueba que demostro el principio de la redireccion especifica del sistema CRISPR Cas llego en 2012 112 y fue un primer paso para la materializacion de propuestas para la biotecnologia derivada de CRISPR 113 Inmunizacion artificial contra fagos por introduccion de locus CRISPR en bacterias industrialmente importantes incluyendo a esas utilizadas en la produccion de comida y fermentaciones a gran escala La ingenieria genetica a nivel celular u organismico al reprogramar un sistema CRISPR Cas para lograr ingenieria del genoma guiada por ARN Los estudios lo han demostrado tanto in vitro 23 48 como in vivo 30 114 115 116 Discriminacion de cepas bacterianas por comparacion de secuencias espaciadorasTerapias Editar Editas Medicine una start up de 43 millones de dolares busca desarrollar tratamientos que usen CRISPR Cas para hacer ediciones desde pares de bases especificas hasta segmentos mas grandes de ADN Algunas enfermedades heredadas como la fibrosis quistica y la anemia son causadas por mutaciones de un solo par de bases la tecnologia CRISPR Cas tiene el potencial de corregir esos errores El gen corregido permanece en su lugar habitual en su cromosoma quien contiene la forma en que la celula normalmente activa o inhibe su expresion 117 Despues de cultivar precursores de celulas sanguineas llamados hemocitoblastos de la medula osea de un paciente la cirugia genetica con CRISPR podria corregir el gen defectuoso Entonces las celulas con el genoma corregido serian reintroducidas a la medula del paciente que ahora producira celulas sanas Reemplazar el 70 de las celulas defectuosas significaria tener una cura 38 Antes de que pueda usarse clinicamente la compania debe poder garantizar que solo la region objetivo sera afectada y debe determinar como entregar la terapia a las celulas del paciente 117 En 2014 investigadores de la UCSF usaron a los CRISPR para crear versiones sanas de celulas madre de pacientes con beta talasemia 118 En 2020 la empresa CRISPR Therapeutics anuncio que a junio de 2020 5 pacientes con beta talasemia y dos pacientes con anemia falciforme habian sido tratados exitosamente con CTX001 119 CTX001 es una terapia en desarrollo que las empresas Vertex Pharmaceuticals y CRISPR Therapeutics tienen en desarrollo 120 En la noticia se indico que dos pacientes de beta talasemia a los 5 y 15 meses despues de la edicion del gen que reprime la expresion del gen de la hemoglobina fetal HbF eran independientes de transfusiones y que un paciente que presenta la enfermedad de celulas falciformes o anemia falciforme a los 9 meses de la edicion CTX001 se presenta libre de las crisis vasooclusivas de la enfermedad Otras patologias que se podrian tratar con CRISPR incluyen la enfermedad de Huntington los efectos de la vejez esquizofrenia y autismo e inclusive la modificacion de ADN en embriones vivos 38 Mejorar el sistema de direccion es fundamental antes de que CRISPR pueda ser utilizado en aplicaciones medicas Los ARN guia existentes podrian trabajar sobre secuencias que difieren en algunas pares de bases de la secuencia objetivo 22 Modelos murinos Editar CRISPR simplifica la creacion de modelos de ratones y reduce el tiempo requerido de meses a tan solo semanas El knockdown de genes endogenos ha sido logrado por transfeccion con un plasmido que contiene un area CRISPR con un espaciador que inhibe un gen objetivo La inyeccion de cigotos de raton con Cas9 y dos ARN guia pudo lograr desactivar dos genes con el 80 de eficacia La llamada reparacion dirigida por homologia involucra el uso de Cas9 para cortar al ADN y asi introducir nuevas partes genicas al cigoto Plantilla Obra citada needed Agricultura Editar Libreria de gusano de la seda con CRISPR Cas9 En 2014 el investigador chino Gao Caixia aplico para patentes para la creacion de una cepa de trigo que es resistente al oidio A la cepa le faltan genes que producen proteinas que reprimen las defensas en contra del oidio Los investigadores borraron todas las copias de los genes del genoma hexaploide del trigo La cepa promete reducir o eliminar el gran uso de fungicidas para controlar la enfermedad Gao uso los sistemas de edicion genica transcription activator like effector nuclease TALENs y CRISPR para agregar o cambiar ningun otro gen Aun no ha habido pruebas de campo 121 122 Entomologia Editar En las celulas diploides eucariotas los analisis de perdida de funcion se han realizado primariamente por siRNA En cambio en los ultimos anos la tecnologia CRISPR asociada a la proteina Cas9 ha adquirido una gran importancia El sistema CRISPR es eficiente identificando genes en la resistencia de farmacos tumorogenesis respuesta inmune interacciones con patogenos e inmunoterapia para el cancer Un ejemplo de esto es el estudio realizado en Bombyx mori que identifico los genes relacionados con su viabilidad celular crecimiento interacciones huesped patogeno y resistencia a la temperatura caracterizando mas de 6000 genes diferentes 123 Identificacion de elementos funcionales en regiones genomicas no codificantes Editar Marcadores moleculares como el estado epigenetico la accesibilidad a la cromatina la vinculacion de factores de transcripcion y la conservacion evolutiva se correlacionan con elementos funcionales putativos en el genoma no codificante y pueden predecir su funcion reguladora 124 Sin embargo estas predicciones superan en gran medida las regiones que carecen de caracteristicas y es dificil determinar que caracteristicas desempenan un papel correlativo o verdaderamente causal en la funcion o en el fenotipo Los esfuerzos para determinar la causalidad se han basado en la utilizacion de fragmentos de ADN preseleccionados 125 basandose en su expresion como sustituto de la funcion pero estos metodos carecen del contexto de la cromatina local y de las interacciones reguladoras mas amplias Por lo tanto existe la necesidad de enfoques sistematicos para cribar variantes no codificantes y determinar si y como afectan a los fenotipos en un contexto biologico nativo Para ello se diseno un metodo de alto rendimiento que utilizaba una biblioteca de ARN guia en CRISPR Cas9 para la deteccion genomica de locus no codificantes con el fin de identificar las regiones funcionales relacionadas con el fenotipo y la regulacion de genes En combinacion con otros ensayos de todo el genoma se demuestra el alto rendimiento de la tecnica en la identificacion de las regiones donde los cambios en el contexto de la cromatina y factores de transcripcion que se unen a estas regiones estan causalmente vinculados a la perdida de expresion genica y un fenotipo relevante de la enfermedad 126 127 Un ejemplo aplicado de esta tecnica es la deteccion de localizaciones genomicas no codificantes que modulan la resistencia a los farmacos El Vemurafenib inhibe las proteinas B Raf portadoras de la mutacion 128 cambio de valina por glutamato en la posicion 600 que se encuentra en el 50 al 70 de los melanomas 129 La resistencia al vemurafenib surge en cuestion de meses en casi todos los pacientes con melanoma y las celulas tumorales supervivientes muestran un aumento de la malignidad que conduce rapidamente a la letalidad 130 131 Una criba de CRISPR a escala genomica encontro que las mutaciones de perdida de funcion en los genes NF1 NF2 y CUL3 producen resistencia a vemurafenib 132 Para explorar si las mutaciones en las regiones no codificantes alrededor de estos tres genes podrian afectar de manera similar a la resistencia a los farmacos se hizo uso de tres bibliotecas de sgRNAs que mapeaban a lo largo de 100kb en las regiones 5 y 3 de las principales isoformas de cada gen Se concluyo que las mutaciones en la region no codificante 5 del gen CUL3 alteran los entornos locales epigeneticos y la interaccion con distintos factores de transcripcion yin yang 1 YY1 zinc finger protein 263 ZNF263 CCCTC binding factor CTCF y el complejo activation protein 1 AP 1 formado por Jun Fos Estas regiones no codificantes son de alta importancia en la regulacion de genes y la resistencia quimioterapeutica y farmacologica En reproduccion humana Editar Este articulo o seccion necesita referencias que aparezcan en una publicacion acreditada Puedes avisar al redactor principal pegando lo siguiente en su pagina de discusion sust Aviso referencias CRISPR Este aviso fue puesto el 11 de enero de 2022 La tecnica CRISPR y la edicion genica podria tener un gran potencial en el campo de la tecnologia de la reproduccion humana Por ejemplo se podrian modificar mutaciones geneticas que puedan hacer peligrar la vida del individuo Sin embargo actualmente el uso de CRISPR y la edicion genetica en este campo aun esta en proceso por asuntos de legalidad y bioeticos principalmente No obstante cabe destacar una noticia relevante en este campo dos mellizas chinas fueron modificadas geneticamente mediante CRISPR para conseguir que fueran resistentes contra el VIH virus causante del SIDA Funciones EditarEdicion Editar Los CRISPRs pueden agregar y eliminar pares de bases en locus de ADN altamente especificos Se han usado los CRISPRs para cortar mas de cinco genes a la vez 22 Knockout reversible Editar Los CRISPRi analogos a los ARNi tienen la capacidad de desactivar los genes en un modo reversible al ser especificos pero sin hacer cortes En bacterias la presencia es lo unico que se necesita para detener la transcripcion pero en aplicaciones de mamiferos una seccion de proteina es anadida Guia al ARN que es especifico para el ADN regulatorio que son promotores que preceden al gen de interes 22 Activacion Editar La Cas9 se uso para llevar factores de transcripcion sinteticos fragmentos proteicos que encienden genes que activaban genes humanos especificos Esta tecnica logro un fuerte efecto al dirigir multiples constructos de CRISPR a lugares ligeramente diferentes en el promotor del gen 22 Los genes incluian algunos atados a enfermedades humanas diferenciacion muscular cancer inflamacion y de produccion de hemoglobina fetal 22 Uso por fagos Editar Otro mecanismo para la defensa de las bacterias contra invasion de fagos es teniendo islas genomicas Un subtipo de islas llamada phage inducible chromosomal island PICI es cortada del cromosoma bacteriano cuando se presenta la infeccion por fago y puede inhibir su replicacion 133 Los mecanismos que inducen el sistema PICI y como PICI inhibe la replicacion del fago no se tienen entendidos hasta ahora Un estudio mostro que el fago litico ICP1 el cual especificamente ataca al serotipo 01 de Vibrio cholerae ha adquirido un sistema CRISPR Cas que apunta a un elemento de tipo PICI en V cholera El sistema tiene dos locus CRISPR y 9 genes Cas Parece ser que es homologo al sistema 1 F system encontrado en Yersinia pestis Ademas igual que el sistema bacteriano CRISPR Cas el sistema ICP1 CRISPR Cas puede adquirir nuevas secuencias lo cual permite al fago co evolucionar con su hospedador 134 Automatizacion y soporte de librerias EditarExiste software gratuito para disenar ARN para poder identificar cualquier gen deseado El repositorio de Addgene ofrece a los academicos la posibilidad de crear su propio sistema CRISPR system por 65 dolares En 2013 Addgene distribuyo mas de 10 000 constructos de CRISPR La asociacion ha recibido secuencias genicas activadoras de CRISPR de 11 equipos de investigacion independientes 22 Propiedad intelectual EditarHasta diciembre de 2014 los derechos sobre la patente de CRISPR estan impugnados 135 Una aplicacion de patente provisional sobre el uso del sistema CRISPR para la edicion de genes y regulacion de expresion genica fue solicitada por el equipo de Doudna el 12 de mayo de 2012 Aplicaciones subsecuentes fueron combinadas el 6 de marzo de 2014 con los resultados siendo publicados por la oficina de patentes estadounidense USPTO 136 Los derechos de patente han sido asignados por los inventores a los regentes de la Universidad de California y la Universidad de Viena Por su parte Feng Zhang en el Broad Institute que habia desarrollado y demostrado la tecnologia CRISPR en celulas humanas ha obtenido una patente de CRISPR para celulas con nucleo celulas de animales incluidos los humanos y de plantas Segun Zhang las predicciones formuladas por Doudna en su propia aplicacion de patente de que su descubrimiento podria funcionar en humanos fueron una mera conjetura mientras que el fue el primero en demostrarlo en un acto de invencion separado y sorprendente 137 Esta segunda patente es controvertida ya que otros cientificos sugieren que en terminos de propiedad intelectual era obvio que la tecnologia CRISPR funcionaria en celulas humanas y por tanto la invencion de Zhang no seria merecedora de una patente propia 137 Desde diciembre de 2014 se espera que Doudna y Charpentier planteen su oposicion contra la patente del Broad Institute En febrero de 2017 la Oficina de Patentes de los Estados Unidos se pronuncio sobre un caso de interferencia de patente presentado por la Universidad de California con respecto a las patentes emitidas al Broad Institute y encontro que las patentes Broad con reivindicaciones que abarcaban la aplicacion de CRISPR cas9 en celulas eucariotas eran distintas de los inventos reclamados por la Universidad de California 138 139 140 Hasta noviembre de 2013 SAGE Labs ahora parte del grupo Horizon Discovery tenia derechos exclusivos de una de esas empresas para producir y vender ratas geneticamente modificadas y derechos no exclusivos para modelos de ratones y conejos 141 En 2015 Thermo Fisher Scientific habia autorizado la propiedad intelectual de ToolGen para desarrollar kits de reactivos CRISPR 142 Hay que aclarar que el sistema CRISPR fue descubierto por primera vez por un grupo de cientificos japoneses en 1987 liderado por Yoshizumi Ishino 11 12 anos despues fue encontrado de nuevo de forma independiente por el microbiologo alicantino Francis Mojica actual profesor titular de la Universidad de Alicante 143 144 Cortadores alternativos Editar CRISPR DR2 Estructura secundaria tomada de la base de datos Rfam Familia RF01315 CRISPR DR5 Estructura secundaria tomada de la base de datos Rfam Familia RF011318 CRISPR DR6 Estructura secundaria tomada de la base de datos Rfam Familia RF01319 CRISPR DR8 Estructura secundaria tomada de la base de datos Rfam Familia RF01321 CRISPR DR9 Estructura secundaria tomada de la base de datos Rfam Familia RF01322 CRISPR DR19 Estructura secundaria tomada de la base de datos Rfam Familia RF01332 CRISPR DR41 Estructura secundaria tomada de la base de datos Rfam Familia RF01350 CRISPR DR52 Estructura secundaria tomada de la base de datos Rfam Familia RF01365 CRISPR DR57 Estructura secundaria tomada de la base de datos Rfam Familia RF01370 CRISPR DR65 Estructura secundaria tomada de la base de datos Rfam Familia RF01378 Riesgos EditarSegun investigadores del Instituto Wellcome Sanger en Inglaterra la edicion genetica puede llevar a mutaciones no directamente relacionadas con el sitio de edicion del genoma La complejidad y la interrelacion entre genes editados y no editados podria afectar a la salud de personas con genes editados 145 En su monografia El fenotipo revolucionario The revolutionary phenotype el neurologo canadiense Jean Francois Gariepy desarrolla una teoria basada en la Hipotesis del mundo de ARN en que la edicion del genoma humano podria llegar a un reemplazo de la reproduccion biologica En lugar de la presente reproduccion biologica podria formarse una reproduccion controlada por cientificos usando programas informaticos para cumplir los deseos de los padres eligiendo una edicion genetica para sus hijos 146 Vease tambien EditarNucleasas con dedos de zinc ADN no codificante CRISPR Cpf1 Edicion de calidad Cas9 Motivo adyacente de protoespaciadorReferencias Editar a b c Horvath P Barrangou R 2010 CRISPR Cas the Immune System of Bacteria and Archaea Science 327 5962 167 170 PMID 20056882 doi 10 1126 science 1179555 Flores J 2016 enero 5 Los origenes bacterianos de la edicion del genoma La Jornada seccion Ciencias p 3a suplemento La Jornada de enmedio Mexico DEMOS Consultado 6 de enero del 2016 Consultado el 5 de abril de 2017 a b c Marraffini LA Sontheimer EJ March 2010 CRISPR interference RNA directed adaptive immunity in bacteria and archaea Nature Reviews Genetics 11 3 181 190 PMC 2928866 PMID 20125085 doi 10 1038 nrg2749 CRISPRdb 71 79 Archaea 463 1008 Bacteria Date 19 6 2010 a b Grissa I Vergnaud G Pourcel C 2007 The CRISPRdb database and tools to display CRISPRs and to generate dictionaries of spacers and repeats BMC Bioinformatics 8 172 PMC 1892036 PMID 17521438 doi 10 1186 1471 2105 8 172 Barrangou R Fremaux C Deveau H Richards M Boyaval P Moineau S Romero D A Horvath P 2007 CRISPR Provides Acquired Resistance Against Viruses in Prokaryotes Science 315 5819 1709 1712 PMID 17379808 doi 10 1126 science 1138140 a b Marraffini LA Sontheimer EJ 2008 CRISPR interference limits horizontal gene transfer in staphylococci by targeting DNA Science 322 5909 1843 5 PMID 19095942 Mali P Esvelt KM Church GM 2013 Cas9 as a versatile tool for engineering biology Nature methods 10 10957 63 PMID 24076990 Kevin M Esvelt Andrea L Smidler Flaminia Catteruccia George M Church 2014 Concerning RNA guided gene drives for the alteration of wild populations eLife doi 10 7554 eLife 03401 Overballe Petersen S Harms K Orlando LA Mayar JV Rasmussen S Dahl TW Rosing MT Poole AM Sicheritz Ponten T Brunak S Inselmann S de Vries J Wackernagel W Pybus OG Nielsen R Johnsen PJ Nielsen KM Willerslev E 2013 Bacterial natural transformation by highly fragmented and damaged DNA Proc Natl Acad Sci U S A 110 49 19860 5 a b http jb asm org content 169 12 5429 long Nucleotide Sequence of the iap Gene Responsible for Alkaline Phosphatase Isozyme Conversion in Escherichia coli and Identification of the Gene Product a b c Ishino Y Shinagawa H Makino K Amemura M Nakata A 1987 Nucleotide sequence of the iap gene responsible for alkaline phosphatase isozyme conversion in Escherichia coli and identification of the gene product J Bacteriol 169 12 5429 33 Mojica F J Juez G Rodriguez Valera F 1 de agosto de 1993 Transcription at different salinities of Haloferax mediterranei sequences adjacent to partially modified PstI sites Molecular Microbiology 9 3 613 621 ISSN 0950 382X PMID 8412707 Consultado el 20 de enero de 2016 Hermans P W van Soolingen D Bik E M de Haas P E Dale J W van Embden J D 1 de agosto de 1991 Insertion element IS987 from Mycobacterium bovis BCG is located in a hot spot integration region for insertion elements in Mycobacterium tuberculosis complex strains Infection and Immunity 59 8 2695 2705 ISSN 0019 9567 PMC 258075 PMID 1649798 Consultado el 20 de enero de 2016 Groenen P M Bunschoten A E van Soolingen D van Embden J D 1 de diciembre de 1993 Nature of DNA polymorphism in the direct repeat cluster of Mycobacterium tuberculosis application for strain differentiation by a novel typing method Molecular Microbiology 10 5 1057 1065 ISSN 0950 382X PMID 7934856 Consultado el 20 de enero de 2016 Mojica F J Ferrer C Juez G Rodriguez Valera F 1 de julio de 1995 Long stretches of short tandem repeats are present in the largest replicons of the Archaea Haloferax mediterranei and Haloferax volcanii and could be involved in replicon partitioning Molecular Microbiology 17 1 85 93 ISSN 0950 382X PMID 7476211 Consultado el 20 de enero de 2016 Mojica FJ Diez Villasenor C Soria E Juez G 2000 Biological significance of a family of regularly spaced repeats in the genomes of Archaea Bacteria and mitochondria Mol Microbiol 36 1 244 6 PMID 10760181 a b Jansen R Embden JD Gaastra W Schouls LM 2002 Identification of genes that are associated with DNA repeats in prokaryotes Mol Microbiol 43 6 1565 75 a b c d Pourcel C Salvignol G Vergnaud G 2005 CRISPR elements in Yersinia pestis acquire new repeats by preferential uptake of bacteriophage DNA and provide additional tools for evolutionary studies Microbiology 151 Pt 3 653 63 a b c Bolotin A Quinquis B Sorokin A Ehrlich SD 2005 Clustered regularly interspaced short palindrome repeats CRISPRs have spacers of extrachromosomal origin Microbiology 151 Pt 8 2551 61 a b Mojica Francisco J M Diez Villasenor Cesar Garcia Martinez Jesus Soria Elena 1 de febrero de 2005 Intervening sequences of regularly spaced prokaryotic repeats derive from foreign genetic elements Journal of Molecular Evolution 60 2 174 182 ISSN 0022 2844 PMID 15791728 doi 10 1007 s00239 004 0046 3 Consultado el 20 de enero de 2016 a b c d e f g h i j k Pennisi E 2013 The CRISPR craze Science 341 6148 833 6 a b Jinek M Chylinski K Fonfara I Hauer M Doudna JA Charpentier E 2012 A programmable dual RNA guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity Science 337 6096 816 21 CRISPR gene therapy Scientists call for more public debate around breakthrough technique Science News The Independent 7 de noviembre de 2013 DiCarlo JE Norville JE Mali P Rios X Aach J Church GM 2013 Genome engineering in Saccharomyces cerevisiae using CRISPR Cas systems Nucleic Acids Res 41 7 4336 43 Hwang WY Fu Y Reyon D Maeder ML Tsai SQ Sander JD Peterson RT Yeh JR Joung JK 2013 Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR Cas system Nat Biotechnol 31 3 227 9 Gratz SJ Cummings AM Nguyen JN Hamm DC Donohue LK Harrison MM Wildonger J O Connor Giles KM 2013 Genome engineering of Drosophila with the CRISPR RNA guided Cas9 nuclease Genetics 194 4 1029 35 Friedland AE Tzur YB Esvelt KM Colaiacovo MP Church GM Calarco JA 2013 Heritable genome editing in C elegans via a CRISPR Cas9 system Nat Methods 10 8 741 3 Jiang W Zhou H Bi H Fromm M Yang B Weeks DP 2013 Demonstration of CRISPR Cas9 sgRNA mediated targeted gene modification in Arabidopsis tobacco sorghum and rice Nucleic Acids Res 41 20 e188 a b Wang H Yang H Shivalila CS Dawlaty MM Cheng AW Zhang F Jaenisch R 2013 One step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR Cas mediated genome engineering Cell 153 4 910 8 Larson MH Gilbert LA Wang X Lim WA Weissman JS Qi LS 2013 CRISPR interference CRISPRi for sequence specific control of gene expression Nat Protoc 8 11 2180 96 Researchers reverse a liver disorder in mice by correcting a mutated gene PhysOrg 30 de marzo de 2014 Consultado el 31 de marzo de 2014 Zetsche B Gootenberg JS Abudayyeh OO Slaymaker IM Makarova KS Essletzbichler P Volz SE Joung J van der Oost J Regev A Koonin EV Zhang F October 2015 Cpf1 is a single RNA guided endonuclease of a class 2 CRISPR Cas system Cell 163 3 759 71 PMID 26422227 doi 10 1016 j cell 2015 09 038 Fonfara I Richter H Bratovic M Le Rhun A Charpentier E April 2016 The CRISPR associated DNA cleaving enzyme Cpf1 also processes precursor CRISPR RNA Nature 532 7600 517 21 PMID 27096362 doi 10 1038 nature17945 Ewen Campen B Perrimon N 2020 Expanding the horizons of genome editing in the fruit fly with Cas12a 117 39 pp 24019 24021 doi 10 1073 pnas 2016446117 Consultado el 18 de enero de 2021 Pausch P Al Shayeb B Bisom Rapp E Tsuchida C A Li Z Cress B F Doudna J A 2020 CRISPR CasF from huge phages is a hypercompact genome editor 369 6501 pp 333 337 doi 10 1126 science abb1400 Consultado el 25 de enero de 2021 Bosh J A Birchak G Perrimon N 2020 Precise genome engineering in Drosophila using prime editing 118 1 doi 10 1073 pnas 2021996118 Consultado el 25 de enero de 2021 a b c Young Susan 11 de febrero de 2014 CRISPR and Other Genome Editing Tools Boost Medical Research and Gene Therapy s Reach MIT Technology Review Technologyreview com Consultado el 13 de abril de 2014 Shipman amp al Seth L 12 de julio de 20147 CRISPR Cas encoding of a digital movie into the genomes of a population of living bacteria Nature Consultado el 16 de julio de 2017 a b c Haft DH Selengut J Mongodin EF Nelson KE 2005 A guild of 45 CRISPR associated Cas protein families and multiple CRISPR Cas subtypes exist in prokaryotic genomes PLoS Comput Biol 1 6 e60 Stern A Keren L Wurtzel O Amitai G Sorek R 2010 Self targeting by CRISPR gene regulation or autoimmunity Trends Genet 26 8 335 40 a b c Tyson Gene W Banfield Jillian F 1 de enero de 2008 Rapidly evolving CRISPRs implicated in acquired resistance of microorganisms to viruses Environmental Microbiology 10 1 200 207 ISSN 1462 2920 PMID 17894817 doi 10 1111 j 1462 2920 2007 01444 x Consultado el 8 de agosto de 2016 a b c Chylinski K Makarova KS Charpentier E Koonin EV 2014 Classification and evolution of type II CRISPR Cas systems Nucleic Acids Res 42 10 6091 105 a b c Wiedenheft B Sternberg SH Doudna JA 15 de febrero de 2012 RNA guided genetic silencing systems in bacteria and archaea Nature 482 7385 331 8 PMID 22337052 Sinkunas T Gasiunas G Fremaux C Barrangou R Horvath P Siksnys V 2011 Cas3 is a single stranded DNA nuclease and ATP dependent helicase in the CRISPR Cas immune system EMBO J 30 7 1335 42 a b c d Aliyari R Ding SW 2009 RNA based viral immunity initiated by the Dicer family of host immune receptors Immunol Rev 227 1 176 88 a b Makarova KS Aravind L Wolf YI Koonin EV 2011 Unification of Cas protein families and a simple scenario for the origin and evolution of CRISPR Cas systems 6 p 38 a b c d Gasiunas Giedrius Barrangou Rodolphe Horvath Philippe Siksnys Virginijus 25 de septiembre de 2012 Cas9 crRNA ribonucleoprotein complex mediates specific DNA cleavage for adaptive immunity in bacteria Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 109 39 E2579 2586 ISSN 1091 6490 PMC 3465414 PMID 22949671 doi 10 1073 pnas 1208507109 Consultado el 8 de agosto de 2016 Chylinski K Le Rhun A Charpentier E 2013 The tracrRNA and Cas9 families of type II CRISPR Cas immunity systems RNA Biol 10 5 726 37 a b Dugar Gaurav Herbig Alexander Forstner Konrad U Heidrich Nadja Reinhardt Richard Nieselt Kay Sharma Cynthia M 1 de mayo de 2013 High resolution transcriptome maps reveal strain specific regulatory features of multiple Campylobacter jejuni isolates PLoS genetics 9 5 e1003495 ISSN 1553 7404 PMC 3656092 PMID 23696746 doi 10 1371 journal pgen 1003495 Consultado el 8 de agosto de 2016 Hatoum Aslan Asma Maniv Inbal Marraffini Luciano A 27 de diciembre de 2011 Mature clustered regularly interspaced short palindromic repeats RNA crRNA length is measured by a ruler mechanism anchored at the precursor processing site Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 108 52 21218 21222 ISSN 1091 6490 PMC 3248500 PMID 22160698 doi 10 1073 pnas 1112832108 Consultado el 20 de mayo de 2016 a b Yosef Ido Goren Moran G Qimron Udi 1 de julio de 2012 Proteins and DNA elements essential for the CRISPR adaptation process in Escherichia coli Nucleic Acids Research 40 12 5569 5576 ISSN 1362 4962 PMC 3384332 PMID 22402487 doi 10 1093 nar gks216 Consultado el 8 de agosto de 2016 a b c d Swarts Daan C Mosterd Cas van Passel Mark W J Brouns Stan J J 1 de enero de 2012 CRISPR interference directs strand specific spacer acquisition PloS One 7 4 e35888 ISSN 1932 6203 PMC 3338789 PMID 22558257 doi 10 1371 journal pone 0035888 Consultado el 8 de agosto de 2016 Babu Mohan Beloglazova Natalia Flick Robert Graham Chris Skarina Tatiana Nocek Boguslaw Gagarinova Alla Pogoutse Oxana et al 1 de enero de 2011 A dual function of the CRISPR Cas system in bacterial antivirus immunity and DNA repair Molecular Microbiology 79 2 484 502 ISSN 1365 2958 PMC 3071548 PMID 21219465 doi 10 1111 j 1365 2958 2010 07465 x Consultado el 20 de mayo de 2016 Se sugiere usar numero autores ayuda Babu Mohan Beloglazova Natalia Flick Robert Graham Chris Skarina Tatiana Nocek Boguslaw Gagarinova Alla Pogoutse Oxana et al 1 de enero de 2011 A dual function of the CRISPR Cas system in bacterial antivirus immunity and DNA repair Molecular Microbiology 79 2 484 502 ISSN 1365 2958 PMC 3071548 PMID 21219465 doi 10 1111 j 1365 2958 2010 07465 x Consultado el 20 de mayo de 2016 Se sugiere usar numero autores ayuda Han Dong Lehmann Kathleen Krauss Gerhard 18 de junio de 2009 SSO1450 a CAS1 protein from Sulfolobus solfataricus P2 with high affinity for RNA and DNA FEBS letters 583 12 1928 1932 ISSN 1873 3468 PMID 19427858 doi 10 1016 j febslet 2009 04 047 Consultado el 20 de mayo de 2016 Wiedenheft Blake Zhou Kaihong Jinek Martin Coyle Scott M Ma Wendy Doudna Jennifer A 10 de junio de 2009 Structural basis for DNase activity of a conserved protein implicated in CRISPR mediated genome defense Structure London England 1993 17 6 904 912 ISSN 1878 4186 PMID 19523907 doi 10 1016 j str 2009 03 019 Consultado el 20 de mayo de 2016 Beloglazova Natalia Brown Greg Zimmerman Matthew D Proudfoot Michael Makarova Kira S Kudritska Marina Kochinyan Samvel Wang Shuren et al 18 de julio de 2008 A novel family of sequence specific endoribonucleases associated with the clustered regularly interspaced short palindromic repeats The Journal of Biological Chemistry 283 29 20361 20371 ISSN 0021 9258 PMC 2459268 PMID 18482976 doi 10 1074 jbc M803225200 Consultado el 20 de mayo de 2016 Se sugiere usar numero autores ayuda Samai Poulami Smith Paul Shuman Stewart 1 de diciembre de 2010 Structure of a CRISPR associated protein Cas2 from Desulfovibrio vulgaris Acta Crystallographica Section F Structural Biology and Crystallization Communications 66 Pt 12 1552 1556 ISSN 1744 3091 PMC 2998353 PMID 21139194 doi 10 1107 S1744309110039801 Consultado el 20 de mayo de 2016 Nam Ki Hyun Ding Fran Haitjema Charles Huang Qingqiu DeLisa Matthew P Ke Ailong 19 de octubre de 2012 Double stranded endonuclease activity in Bacillus halodurans clustered regularly interspaced short palindromic repeats CRISPR associated Cas2 protein The Journal of Biological Chemistry 287 43 35943 35952 ISSN 1083 351X PMC 3476262 PMID 22942283 doi 10 1074 jbc M112 382598 Consultado el 20 de mayo de 2016 a b Mojica F J M Diez Villasenor C Garcia Martinez J Almendros C 1 de marzo de 2009 Short motif sequences determine the targets of the prokaryotic CRISPR defence system Microbiology Reading England 155 Pt 3 733 740 ISSN 1350 0872 PMID 19246744 doi 10 1099 mic 0 023960 0 Consultado el 20 de enero de 2016 a b c d Horvath Philippe Romero Dennis A Coute Monvoisin Anne Claire Richards Melissa Deveau Helene Moineau Sylvain Boyaval Patrick Fremaux Christophe et al 1 de febrero de 2008 Diversity activity and evolution of CRISPR loci in Streptococcus thermophilus Journal of Bacteriology 190 4 1401 1412 ISSN 1098 5530 PMC 2238196 PMID 18065539 doi 10 1128 JB 01415 07 Consultado el 8 de agosto de 2016 Se sugiere usar numero autores ayuda a b c Deveau Helene Barrangou Rodolphe Garneau Josiane E Labonte Jessica Fremaux Christophe Boyaval Patrick Romero Dennis A Horvath Philippe et al 1 de febrero de 2008 Phage response to CRISPR encoded resistance in Streptococcus thermophilus Journal of Bacteriology 190 4 1390 1400 ISSN 1098 5530 PMC 2238228 PMID 18065545 doi 10 1128 JB 01412 07 Consultado el 8 de agosto de 2016 Se sugiere usar numero autores ayuda a b Lillestol Reidun K Shah Shiraz A Brugger Kim Redder Peter Phan Hien Christiansen Jan Garrett Roger A 1 de abril de 2009 CRISPR families of the crenarchaeal genus Sulfolobus bidirectional transcription and dynamic properties Molecular Microbiology 72 1 259 272 ISSN 1365 2958 PMID 19239620 doi 10 1111 j 1365 2958 2009 06641 x Consultado el 8 de agosto de 2016 a b Shah SA Hansen NR Garrett RA 2009 Distribution of CRISPR spacer matches in viruses and plasmids of crenarchaeal acidothermophiles and implications for their inhibitory mechanism Biochem Soc Trans 37 Pt 1 23 8 a b Diez Villasenor Cesar Guzman Noemi M Almendros Cristobal Garcia Martinez Jesus Mojica Francisco J M 1 de mayo de 2013 CRISPR spacer integration reporter plasmids reveal distinct genuine acquisition specificities among CRISPR Cas I E variants of Escherichia coli RNA biology 10 5 792 802 ISSN 1555 8584 PMC 3737337 PMID 23445770 doi 10 4161 rna 24023 Consultado el 8 de agosto de 2016 a b c Erdmann Susanne Garrett Roger A 1 de septiembre de 2012 Selective and hyperactive uptake of foreign DNA by adaptive immune systems of an archaeon via two distinct mechanisms Molecular Microbiology 85 6 1044 1056 ISSN 1365 2958 PMC 3468723 PMID 22834906 doi 10 1111 j 1365 2958 2012 08171 x Consultado el 8 de agosto de 2016 a b Shah Shiraz A Erdmann Susanne Mojica Francisco J M Garrett Roger A 1 de mayo de 2013 Protospacer recognition motifs mixed identities and functional diversity RNA biology 10 5 891 899 ISSN 1555 8584 PMC 3737346 PMID 23403393 doi 10 4161 rna 23764 Consultado el 8 de agosto de 2016 Andersson Anders F Banfield Jillian F 23 de mayo de 2008 Virus population dynamics and acquired virus resistance in natural microbial communities Science New York N Y 320 5879 1047 1050 ISSN 1095 9203 PMID 18497291 doi 10 1126 science 1157358 Consultado el 20 de mayo de 2016 a b c d Pride David T Sun Christine L Salzman Julia Rao Nitya Loomer Peter Armitage Gary C Banfield Jillian F Relman David A 1 de enero de 2011 Analysis of streptococcal CRISPRs from human saliva reveals substantial sequence diversity within and between subjects over time Genome Research 21 1 126 136 ISSN 1549 5469 PMC 3012920 PMID 21149389 doi 10 1101 gr 111732 110 Consultado el 8 de agosto de 2016 a b Goren Moran G Yosef Ido Auster Oren Qimron Udi 12 de octubre de 2012 Experimental definition of a clustered regularly interspaced short palindromic duplicon in Escherichia coli Journal of Molecular Biology 423 1 14 16 ISSN 1089 8638 PMID 22771574 doi 10 1016 j jmb 2012 06 037 Consultado el 8 de agosto de 2016 a b c Datsenko Kirill A Pougach Ksenia Tikhonov Anton Wanner Barry L Severinov Konstantin Semenova Ekaterina 1 de enero de 2012 Molecular memory of prior infections activates the CRISPR Cas adaptive bacterial immunity system Nature Communications 3 945 ISSN 2041 1723 PMID 22781758 doi 10 1038 ncomms1937 Consultado el 8 de agosto de 2016 Tang TH Bachellerie JP Rozhdestvensky T Bortolin ML Huber H Drungowski M Elge T Brosius J et al 28 de mayo de 2002 Identification of 86 candidates for small non messenger RNAs from the archaeon Archaeoglobus fulgidus Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 99 11 7536 41 PMID 12032318 Se sugiere usar numero autores ayuda Tang TH Polacek N Zywicki M Huber H Brugger K Garrett R Bachellerie JP Huttenhofer A de enero de 2005 Identification of novel non coding RNAs as potential antisense regulators in the archaeon Sulfolobus solfataricus Molecular microbiology 55 2 469 81 PMID 15659164 Gesner EM Schellenberg MJ Garside EL George MM Macmillan AM de junio de 2011 Recognition and maturation of effector RNAs in a CRISPR interference pathway Nature structural amp molecular biology 18 6 688 92 PMID 21572444 Sashital DG Jinek M Doudna JA de junio de 2011 An RNA induced conformational change required for CRISPR RNA cleavage by the endoribonuclease Cse3 Nature structural amp molecular biology 18 6 680 7 PMID 21572442 Haurwitz RE Jinek M Wiedenheft B Zhou K Doudna JA 10 de septiembre de 2010 Sequence and structure specific RNA processing by a CRISPR endonuclease Science New York N Y 329 5997 1355 8 PMID 20829488 a b c Kunin Victor Sorek Rotem Hugenholtz Philip 1 de enero de 2007 Evolutionary conservation of sequence and secondary structures in CRISPR repeats Genome Biology 8 4 R61 ISSN 1474 760X PMC 1896005 PMID 17442114 doi 10 1186 gb 2007 8 4 r61 Consultado el 8 de agosto de 2016 Carte J Wang R Li H Terns RM Terns MP 15 de diciembre de 2008 Cas6 is an endoribonuclease that generates guide RNAs for invader defense in prokaryotes Genes amp development 22 24 3489 96 PMID 19141480 Wang R Preamplume G Terns MP Terns RM Li H 9 de febrero de 2011 Interaction of the Cas6 riboendonuclease with CRISPR RNAs recognition and cleavage Structure London England 1993 19 2 257 64 PMID 21300293 Niewoehner O Jinek M Doudna JA de enero de 2014 Evolution of CRISPR RNA recognition and processing by Cas6 endonucleases Nucleic acids research 42 2 1341 53 PMID 24150936 Garneau JE Dupuis ME Villion M Romero DA Barrangou R Boyaval P Fremaux C Horvath P Magadan AH Moineau S 4 de noviembre de 2010 The CRISPR Cas bacterial immune system cleaves bacteriophage and plasmid DNA Nature 468 7320 67 71 PMID 21048762 Semenova E Jore MM Datsenko KA Semenova A Westra ER Wanner B van der Oost J Brouns SJ et al 21 de junio de 2011 Interference by clustered regularly interspaced short palindromic repeat CRISPR RNA is governed by a seed sequence Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 108 25 10098 103 PMID 21646539 Se sugiere usar numero autores ayuda Gudbergsdottir S Deng L Chen Z Jensen JV Jensen LR She Q Garrett RA de enero de 2011 Dynamic properties of the Sulfolobus CRISPR Cas and CRISPR Cmr systems when challenged with vector borne viral and plasmid genes and protospacers Molecular microbiology 79 1 35 49 PMID 21166892 Manica A Zebec Z Teichmann D Schleper C de abril de 2011 In vivo activity of CRISPR mediated virus defence in a hyperthermophilic archaeon Molecular microbiology 80 2 481 91 PMID 21385233 Jore MM Lundgren M van Duijn E Bultema JB Westra ER Waghmare SP Wiedenheft B Pul U Wurm R Wagner R Beijer MR Barendregt A Zhou K Snijders AP Dickman MJ Doudna JA Boekema EJ Heck AJ van der Oost J Brouns SJ de mayo de 2011 Structural basis for CRISPR RNA guided DNA recognition by Cascade Nature structural amp molecular biology 18 5 529 36 PMID 21460843 Wiedenheft B Lander GC Zhou K Jore MM Brouns SJ van der Oost J Doudna JA Nogales E 21 de septiembre de 2011 Structures of the RNA guided surveillance complex from a bacterial immune system Nature 477 7365 486 9 PMID 21938068 Zhang J Rouillon C Kerou M Reeks J Brugger K Graham S Reimann J Cannone G Liu H Albers SV Naismith JH Spagnolo L White MF 10 de febrero de 2012 Structure and mechanism of the CMR complex for CRISPR mediated antiviral immunity Molecular cell 45 3 303 13 PMID 22227115 a b Hale Caryn R Zhao Peng Olson Sara Duff Michael O Graveley Brenton R Wells Lance Terns Rebecca M Terns Michael P 25 de noviembre de 2009 RNA guided RNA cleavage by a CRISPR RNA Cas protein complex Cell 139 5 945 956 ISSN 1097 4172 PMC 2951265 PMID 19945378 doi 10 1016 j cell 2009 07 040 Consultado el 8 de agosto de 2016 Deng Ling Garrett Roger A Shah Shiraz A Peng Xu She Qunxin 1 de marzo de 2013 A novel interference mechanism by a type IIIB CRISPR Cmr module in Sulfolobus Molecular Microbiology 87 5 1088 1099 ISSN 1365 2958 PMID 23320564 doi 10 1111 mmi 12152 Consultado el 8 de agosto de 2016 a b c Marraffini Luciano A Sontheimer Erik J 28 de enero de 2010 Self versus non self discrimination during CRISPR RNA directed immunity Nature 463 7280 568 571 ISSN 1476 4687 PMC 2813891 PMID 20072129 doi 10 1038 nature08703 Consultado el 8 de agosto de 2016 Kellie Shaefer 29 de mayo de 2017 Unexpected mutations after CRISPR Cas9 editing in vivo Nature Methods Consultado el 30 de julio de 2017 Derek Lowe 31 de mayo de 2017 Trouble with CRISPR Maybe But Maybe Not Science Consultado el 30 de julio de 2017 Whole Genome Sequencing Analysis Reveals High Specificity of CRISPR Cas9 and TALEN Based Genome Editing in Human iPSCs Digenome seq genome wide profiling of CRISPR Cas9 off target effects in human cells Targeted and genome wide sequencing reveal single nucleotide variations impacting specificity of Cas9 in human stem cells Suh Yousin 14 de diciembre de 2017 Faculty of 1000 evaluation for CIRCLE seq a highly sensitive in vitro screen for genome wide CRISPR Cas9 nuclease off targets F1000 Post publication peer review of the biomedical literature Consultado el 6 de enero de 2019 Joung J Keith Maresca Marcello Aryee Martin J Bohlooly Y Mohammad Pinello Luca Mayr Lorenz M Nitsch Roberto Nguyen Nhu T et al 2018 09 In vivo CRISPR editing with no detectable genome wide off target mutations Nature en ingles 561 7723 416 419 ISSN 1476 4687 PMC 6194229 PMID 30209390 doi 10 1038 s41586 018 0500 9 Consultado el 6 de enero de 2019 Se sugiere usar numero autores ayuda Touchon Marie Rocha Eduardo P C 1 de enero de 2010 The small slow and specialized CRISPR and anti CRISPR of Escherichia and Salmonella PloS One 5 6 e11126 ISSN 1932 6203 PMC 2886076 PMID 20559554 doi 10 1371 journal pone 0011126 Consultado el 8 de agosto de 2016 a b c Rho Mina Wu Yu Wei Tang Haixu Doak Thomas G Ye Yuzhen 1 de enero de 2012 Diverse CRISPRs evolving in human microbiomes PLoS genetics 8 6 e1002441 ISSN 1553 7404 PMC 3374615 PMID 22719260 doi 10 1371 journal pgen 1002441 Consultado el 8 de agosto de 2016 a b Sun Christine L Barrangou Rodolphe Thomas Brian C Horvath Philippe Fremaux Christophe Banfield Jillian F 1 de febrero de 2013 Phage mutations in response to CRISPR diversification in a bacterial population Environmental Microbiology 15 2 463 470 ISSN 1462 2920 PMID 23057534 doi 10 1111 j 1462 2920 2012 02879 x Consultado el 8 de agosto de 2016 Kuno Sotaro Sako Yoshihiko Yoshida Takashi 1 de mayo de 2014 Diversification of CRISPR within coexisting genotypes in a natural population of the bloom forming cyanobacterium Microcystis aeruginosa Microbiology Reading England 160 Pt 5 903 916 ISSN 1465 2080 PMID 24586036 doi 10 1099 mic 0 073494 0 Consultado el 8 de agosto de 2016 Bland Charles Ramsey Teresa L Sabree Fareedah Lowe Micheal Brown Kyndall Kyrpides Nikos C Hugenholtz Philip 1 de enero de 2007 CRISPR recognition tool CRT a tool for automatic detection of clustered regularly interspaced palindromic repeats BMC bioinformatics 8 209 ISSN 1471 2105 PMC 1924867 PMID 17577412 doi 10 1186 1471 2105 8 209 Consultado el 8 de agosto de 2016 Edgar Robert C 1 de enero de 2007 PILER CR fast and accurate identification of CRISPR repeats BMC bioinformatics 8 18 ISSN 1471 2105 PMC 1790904 PMID 17239253 doi 10 1186 1471 2105 8 18 Consultado el 8 de agosto de 2016 Grissa Ibtissem Vergnaud Gilles Pourcel Christine 1 de julio de 2007 CRISPRFinder a web tool to identify clustered regularly interspaced short palindromic repeats Nucleic Acids Research 35 Web Server issue W52 57 ISSN 1362 4962 PMC 1933234 PMID 17537822 doi 10 1093 nar gkm360 Consultado el 8 de agosto de 2016 Pride David T Salzman Julia Relman David A 1 de septiembre de 2012 Comparisons of clustered regularly interspaced short palindromic repeats and viromes in human saliva reveal bacterial adaptations to salivary viruses Environmental Microbiology 14 9 2564 2576 ISSN 1462 2920 PMC 3424356 PMID 22583485 doi 10 1111 j 1462 2920 2012 02775 x Consultado el 8 de agosto de 2016 Held Nicole L Herrera Alfa Whitaker Rachel J 1 de noviembre de 2013 Reassortment of CRISPR repeat spacer loci in Sulfolobus islandicus Environmental Microbiology 15 11 3065 3076 ISSN 1462 2920 PMID 23701169 doi 10 1111 1462 2920 12146 Consultado el 8 de agosto de 2016 Held Nicole L Herrera Alfa Cadillo Quiroz Hinsby Whitaker Rachel J 1 de enero de 2010 CRISPR associated diversity within a population of Sulfolobus islandicus PloS One 5 9 ISSN 1932 6203 PMC 2946923 PMID 20927396 doi 10 1371 journal pone 0012988 Consultado el 8 de agosto de 2016 Skennerton Connor T Imelfort Michael Tyson Gene W 1 de mayo de 2013 Crass identification and reconstruction of CRISPR from unassembled metagenomic data Nucleic Acids Research 41 10 e105 ISSN 1362 4962 PMC 3664793 PMID 23511966 doi 10 1093 nar gkt183 Consultado el 8 de agosto de 2016 Koonin Eugene V Wolf Yuri I 1 de enero de 2009 Is evolution Darwinian or and Lamarckian Biology Direct 4 42 ISSN 1745 6150 PMC 2781790 PMID 19906303 doi 10 1186 1745 6150 4 42 Consultado el 8 de agosto de 2016 Heidelberg John F Nelson William C Schoenfeld Thomas Bhaya Devaki 1 de enero de 2009 Germ warfare in a microbial mat community CRISPRs provide insights into the co evolution of host and viral genomes PloS One 4 1 e4169 ISSN 1932 6203 PMC 2612747 PMID 19132092 doi 10 1371 journal pone 0004169 Consultado el 8 de agosto de 2016 Sampson Timothy R Saroj Sunil D Llewellyn Anna C Tzeng Yih Ling Weiss David S 9 de mayo de 2013 A CRISPR Cas system mediates bacterial innate immune evasion and virulence Nature 497 7448 254 257 ISSN 1476 4687 PMC 3651764 PMID 23584588 doi 10 1038 nature12048 Consultado el 8 de agosto de 2016 Hale Caryn R Majumdar Sonali Elmore Joshua Pfister Neil Compton Mark Olson Sara Resch Alissa M Glover Claiborne V C Graveley Brenton R Terns Rebecca M Terns Michael P 10 de febrero de 2012 Essential features and rational design of CRISPR RNAs that function with the Cas RAMP module complex to cleave RNAs Molecular Cell 45 3 292 302 ISSN 1097 4164 PMC 3278580 PMID 22227116 doi 10 1016 j molcel 2011 10 023 Consultado el 8 de agosto de 2016 Sorek Rotem Kunin Victor Hugenholtz Philip 1 de marzo de 2008 CRISPR a widespread system that provides acquired resistance against phages in bacteria and archaea Nature Reviews Microbiology 6 3 181 186 ISSN 1740 1534 PMID 18157154 doi 10 1038 nrmicro1793 Consultado el 8 de agosto de 2016 Cong Le Ran F Ann Cox David Lin Shuailiang Barretto Robert Habib Naomi Hsu Patrick D Wu Xuebing Jiang Wenyan Marraffini Luciano A Zhang Feng 15 de febrero de 2013 Multiplex genome engineering using CRISPR Cas systems Science New York N Y 339 6121 819 823 ISSN 1095 9203 PMC 3795411 PMID 23287718 doi 10 1126 science 1231143 Consultado el 8 de agosto de 2016 Mali Prashant Yang Luhan Esvelt Kevin M Aach John Guell Marc DiCarlo James E Norville Julie E Church George M 15 de febrero de 2013 RNA guided human genome engineering via Cas9 Science New York N Y 339 6121 823 826 ISSN 1095 9203 PMC 3712628 PMID 23287722 doi 10 1126 science 1232033 Consultado el 8 de agosto de 2016 Hou Z Zhang Y Propson N Howden S Chu L Sontheimer E et al 2013 Efficient genome engineering in human pluripotent stem cells using Cas9 from Neisseria meningitidis Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 110 39 15644 doi 10 1073 pnas 1313587110 a b Young Susan Biotech Startup Editas Medicine Wants to Cure Grievous Genetic Diseases with New Genome Editing Technology MIT Technology Review Technologyreview com Consultado el 30 de noviembre de 2013 Seamless gene correction of b thalassemia mutations in patient specific iPSCs using CRISPR Cas9 and piggyBac Eides Rachel 12 de junio de 2020 CRISPR Therapeutics and Vertex Announce New Clinical Data for Investigational Gene Editing Therapy CTX001 in Severe Hemoglobinopathies at the 25th Annual European Hematology Association EHA Congress Consultado el 21 de junio de 2020 Silva Joana Cavaco 13 de mayo de 2020 CTX001 Consultado el 24 de junio de 2020 Talbot David 19 de julio de 2014 Beijing Researchers Use Gene Editing to Create Disease Resistant Wheat MIT Technology Review Technologyreview com Consultado el 23 de julio de 2014 Wang Yanpeng 2014 Simultaneous editing of three homoeoalleles in hexaploid bread wheat confers heritable resistance to powdery mildew Nature Biotechnology doi 10 1038 nbt 2969 Chang Jiasong et al Genome wide CRISPR Screening Reveals Genes Essential for Cell Viability and Resistance to Abiotic and Biotic Stresses in Bombyx Mori Genome Research vol 30 no 5 2020 pp 757 767 ENCODE Project Consortium 6 de septiembre de 2012 An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome Nature 489 7414 57 74 ISSN 1476 4687 PMC 3439153 PMID 22955616 doi 10 1038 nature11247 Consultado el 18 de febrero de 2017 Melnikov Alexandre Murugan Anand Zhang Xiaolan Tesileanu Tiberiu Wang Li Rogov Peter Feizi Soheil Gnirke Andreas et al Systematic dissection and optimization of inducible enhancers in human cells using a massively parallel reporter assay Nature Biotechnology 30 3 271 277 PMC 3297981 PMID 22371084 doi 10 1038 nbt 2137 Se sugiere usar numero autores ayuda Targeting the Noncoding Genome with CRISPR 29 de septiembre de 2016 Sanjana Neville E Wright Jason Zheng Kaijie Shalem Ophir Fontanillas Pierre Joung Julia Cheng Christine Regev Aviv et al 30 de septiembre de 2016 High resolution interrogation of functional elements in the noncoding genome Science en ingles 353 6307 1545 1549 ISSN 0036 8075 PMC 5144102 PMID 27708104 doi 10 1126 science aaf7613 Consultado el 18 de febrero de 2017 Se sugiere usar numero autores ayuda V600E Akbani Rehan Akdemir Kadir C Aksoy B Arman Albert Monique Ally Adrian Amin Samirkumar B Arachchi Harindra Arora Arshi et al Genomic Classification of Cutaneous Melanoma Cell 161 7 1681 1696 PMC 4580370 PMID 26091043 doi 10 1016 j cell 2015 05 044 Se sugiere usar numero autores ayuda Sosman Jeffrey A Kim Kevin B Schuchter Lynn Gonzalez Rene Pavlick Anna C Weber Jeffrey S McArthur Grant A Hutson Thomas E et al 23 de febrero de 2012 Survival in BRAF V600 Mutant Advanced Melanoma Treated with Vemurafenib New England Journal of Medicine 366 8 707 714 ISSN 0028 4793 PMC 3724515 PMID 22356324 doi 10 1056 NEJMoa1112302 Consultado el 18 de febrero de 2017 Se sugiere usar numero autores ayuda Zubrilov Inna Sagi Assif Orit Izraely Sivan Meshel Tsipi Ben Menahem Shlomit Ginat Ravit Pasmanik Chor Metsada Nahmias Clara et al Vemurafenib resistance selects for highly malignant brain and lung metastasizing melanoma cells Cancer Letters 361 1 86 96 doi 10 1016 j canlet 2015 02 041 Se sugiere usar numero autores ayuda Shalem Ophir Sanjana Neville E Hartenian Ella Shi Xi Scott David A Mikkelsen Tarjei S Heckl Dirk Ebert Benjamin L et al 3 de enero de 2014 Genome Scale CRISPR Cas9 Knockout Screening in Human Cells Science en ingles 343 6166 84 87 ISSN 0036 8075 PMC 4089965 PMID 24336571 doi 10 1126 science 1247005 Consultado el 18 de febrero de 2017 Se sugiere usar numero autores ayuda Novick Richard P Christie Gail E Penades Jose R 1 de agosto de 2010 The phage related chromosomal islands of Gram positive bacteria Nature Reviews Microbiology 8 8 541 551 ISSN 1740 1534 PMC 3522866 PMID 20634809 doi 10 1038 nrmicro2393 Consultado el 8 de agosto de 2016 Seed Kimberley D Lazinski David W Calderwood Stephen B Camilli Andrew 28 de febrero de 2013 A bacteriophage encodes its own CRISPR Cas adaptive response to evade host innate immunity Nature 494 7438 489 491 ISSN 1476 4687 PMC 3587790 PMID 23446421 doi 10 1038 nature11927 Consultado el 8 de agosto de 2016 Who Owns the Biggest Biotech Discovery of the Century There s a bitter fight over the patents for CRISPR a breakthrough new form of DNA editing MIT Technology Review Consultado el 25 de febrero de 2015 CRISPR Patents Spark Fight to Control Genome Editing Methods And Compositions For Rna directed Target Dna Modification And For Rna directed Modulation Of Transcription Freshpatents com Consultado el 13 de abril de 2014 a b Who Owns the Biggest Biotech Discovery of the Century Antonio Regalado Technology Review 04 December 2014 Pollack Andrew 15 de febrero de 2017 Harvard and M I T Scientists Win Gene Editing Patent Fight The New York Times Akst Jef 15 de febrero de 2017 Broad Wins CRISPR Patent Interference Case The Scientist Magazine Noonan Kevin E 16 de febrero de 2017 PTAB Decides CRISPR Interference in Favor of Broad Institute Their Reasoning Patent Docs CRISPR Madness GEN Staff 1 de abril de 2015 News Products amp Services Genetic Engineering amp Biotechnology News Paper 35 7 8 http www cell com cell fulltext S0092 8674 15 01705 5 The Heroes of CRISPR http www agenciasinc es Entrevistas Estoy viviendo la revolucion CRISPR con agobio y felicidad Consultado el 5 de abril de 2017 Alejandra Martins 2018 CRISPR Cas9 las serias advertencias de unos cientificos sobre los peligros de la tecnica que revoluciono la genetica Jean Francois Gariepy 2018 The revolutionary phenotype en ingles p 92 95 ISBN 9781729861561 Datos Q412563 Multimedia CRISPR Obtenido de https es wikipedia org w index php title CRISPR amp oldid 141075587, wikipedia, wiki, leyendo, leer, libro, biblioteca,

español

, española, descargar, gratis, descargar gratis, mp3, video, mp4, 3gp, jpg, jpeg, gif, png, imagen, música, canción, película, libro, juego, juegos