El cromosoma artificial de levaduras o YAC (Yeast artificial chromosome) forma parte de los vectores de clonación de alta capacidad siendo, de hecho, el de mayor capacidad (200 kb - 3.000 kb). Fueron descritos por primera vez en 1983 por Murray y Szostack.
Es un vector que pretende imitar las características de un cromosoma normal de una levadura (eucariota), portando un centrómero y telómeros terminales. Esto permite clonar en levaduras (microorganismos eucariotas) secuencias de ADN de hasta un millón de pares de bases o más, al comportarse como un cromosoma propio de la levadura.
Son utilizados en construcción de genotecas genómicas, siendo muy extendido su uso en los primeros años del Proyecto Genoma Humano. Sin embargo, son más inestables que otros vectores como BACs (cromosoma artificial bacteriano), que han acabado imponiéndose.
Los YAC tienen un origen de replicación relajado en procariotas, por lo que aparecen muchas copias en cada bacteria (gran utilidad para producir masivamente el vector), pero un origen de replicación estricto en levaduras, apareciendo sólo una copia por célula de levadura.
SUP4: cambia la mutación sin sentido ámbar (UAG) por la incorporación de tirosina. Identifica las células que incorporan el vector, ya que las células huésped que portan esta mutación ámbar, de color rosado, pasan a tener un fenotipo blanco. (Prototrofo para ade).
Procedimiento de clonación
a) Digestión con BamHI y EcoRI. Desfosforilación de los extremos 5’. Esto linealiza el vector, dejando funcionales las secuencias teloméricas. Se eliminan los marcadores His3 y Sup4.
b) Digestión de nuestra muestra con EcoRI. Selección de los fragmentos por electroforesis y purificación.
c) Reacción de ligación: Da una molécula con un centrómero y telómeros terminales.
d) Se induce su entrada en células por electroporación. Se clonan en gran cantidad en bacterias. Luego se extraen y purifican y se introducen en levaduras por electroporación.
e) Se seleccionan las levaduras que portan el vector mediante cultivo en un medio de cultivo sin Trp, sin Ura, con His y con Adenina. Las colonias capaces de crecer en este medio y que tengan coloración rosada (rotura del SUP4 como consecuencia de la entrada del inserto), serán las que tengan los clones que nos interesan.
f) El vector se comporta como un cromosoma más de la levadura.
Murray AW, Szostak JW (1983): Construction of artificial chromosomes in yeast, Nature 305, 2049-2054
Larin Z, Monaco AP, Lehrach H (1991): Yeast artificial chromosome libraries containing large inserts from mouse and human DNA, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 88, 4123-4127
Bellanné-Chantelot C et al. (1992): Mapping the whole human genome by fingerprinting yeast artificial chromosomes, Cell 70, 1059-1068
Datos:Q420895
Agosto 10, 2021
cromosoma, artificial, levadura, cromosoma, artificial, levaduras, yeast, artificial, chromosome, forma, parte, vectores, clonación, alta, capacidad, siendo, hecho, mayor, capacidad, fueron, descritos, primera, 1983, murray, szostack, vector, pretende, imitar,. El cromosoma artificial de levaduras o YAC Yeast artificial chromosome forma parte de los vectores de clonacion de alta capacidad siendo de hecho el de mayor capacidad 200 kb 3 000 kb Fueron descritos por primera vez en 1983 por Murray y Szostack Es un vector que pretende imitar las caracteristicas de un cromosoma normal de una levadura eucariota portando un centromero y telomeros terminales Esto permite clonar en levaduras microorganismos eucariotas secuencias de ADN de hasta un millon de pares de bases o mas al comportarse como un cromosoma propio de la levadura Son utilizados en construccion de genotecas genomicas siendo muy extendido su uso en los primeros anos del Proyecto Genoma Humano Sin embargo son mas inestables que otros vectores como BACs cromosoma artificial bacteriano que han acabado imponiendose Los YAC tienen un origen de replicacion relajado en procariotas por lo que aparecen muchas copias en cada bacteria gran utilidad para producir masivamente el vector pero un origen de replicacion estricto en levaduras apareciendo solo una copia por celula de levadura Un YAC tipico tiene ARS1 secuencia de replicacion autonoma CEN4 centromero del cromosoma IV permite la segregacion del plasmido durante la division celular TELs secuencias telomericas HIS3 TRP1 URA3 marcadores de seleccion en levadura confieren prototrofia para histidina triptofano y uracilo SUP4 cambia la mutacion sin sentido ambar UAG por la incorporacion de tirosina Identifica las celulas que incorporan el vector ya que las celulas huesped que portan esta mutacion ambar de color rosado pasan a tener un fenotipo blanco Prototrofo para ade Procedimiento de clonacion Editara Digestion con BamHI y EcoRI Desfosforilacion de los extremos 5 Esto linealiza el vector dejando funcionales las secuencias telomericas Se eliminan los marcadores His3 y Sup4 b Digestion de nuestra muestra con EcoRI Seleccion de los fragmentos por electroforesis y purificacion c Reaccion de ligacion Da una molecula con un centromero y telomeros terminales d Se induce su entrada en celulas por electroporacion Se clonan en gran cantidad en bacterias Luego se extraen y purifican y se introducen en levaduras por electroporacion e Se seleccionan las levaduras que portan el vector mediante cultivo en un medio de cultivo sin Trp sin Ura con His y con Adenina Las colonias capaces de crecer en este medio y que tengan coloracion rosada rotura del SUP4 como consecuencia de la entrada del inserto seran las que tengan los clones que nos interesan f El vector se comporta como un cromosoma mas de la levadura Vease tambien EditarContigo Genoma Cromosoma artificial bacterianoReferencias EditarMurray AW Szostak JW 1983 Construction of artificial chromosomes in yeast Nature 305 2049 2054 Larin Z Monaco AP Lehrach H 1991 Yeast artificial chromosome libraries containing large inserts from mouse and human DNA Proceedings of the National Academy of Sciences USA 88 4123 4127 Bellanne Chantelot C et al 1992 Mapping the whole human genome by fingerprinting yeast artificial chromosomes Cell 70 1059 1068 Datos Q420895Obtenido de https es wikipedia org w index php title Cromosoma artificial de levadura amp oldid 118760201, wikipedia, wiki, leyendo, leer, libro, biblioteca,
