Aislamiento de plásmidos con miniprep y digestión con enzimas de restricción.
Características
El método más común para ello es romper las células de dicho cultivo mediante un choque alcalino de modo que solo permee selectivamente su ADN plasmídico. Para ello, se toma un volumen de 2-5 mL de un cultivo crecido en medio líquido y se centrifuga, aislando así las células de aquel. Después, se resuspende dicho sedimento y se expone dicha suspensión a una disolución que contiene NaOH y dodecilsulfato de sodio (SDS), la cual solubiliza en parte la membrana externa de las bacteriasGram negativas, lo que produce la liberación del contenido celular de éstas: ADN genómico y plasmídico desnaturalizados, ARN, proteínas... Tras esto, se añade a la mezcla acetato potásico, acídico, lo cual neutraliza todo los desechos celulares y provoca la rápida renaturalización del ADN plasmídico, que queda en suspensión, mientras que el genómico y el resto de componentes celulares se reticulan y precipitan ayudados por la alta concentración de sales, especialmente del recién generado dodecil sulfato de potasio. Finalmente, se centrifuga nuevamente la mezcla para aislar el sobrenadante, rico en el ADN plasmídico y en ARN, el cual deberá ser eliminado mediante una ribonucleasa. El protocolo se puede mejorar con la fenolización (fenol + cloroformo isoamílico) de las muestras de ADN.
La miniprep es la técnica inicial de purificación y concentración de ADN plasmídico para cualquiera de sus posibles fines, entre los que destaca la clonación (biología).
Referencias
Birnboim HC, Doly J Nucleic Acids Res. 1979 Nov 24;7(6):1513-23.
Enlaces externos
Protocolo general de lisis alcalina. En inglés.
Datos:Q455079
Enero 14, 2023
miniprep, miniprep, extracción, naturaleza, plasmídica, cultivo, bacteriano, agarosa, teñido, bromuro, etidio, mostrando, serie, plásmidos, purificados, mediante, miniprep, aislamiento, plásmidos, miniprep, digestión, enzimas, restricción, características, edi. Una miniprep es una extraccion de ADN de naturaleza plasmidica de un cultivo bacteriano Gel de agarosa tenido con bromuro de etidio mostrando una serie de plasmidos purificados mediante miniprep Aislamiento de plasmidos con miniprep y digestion con enzimas de restriccion Caracteristicas EditarEl metodo mas comun para ello es romper las celulas de dicho cultivo mediante un choque alcalino de modo que solo permee selectivamente su ADN plasmidico Para ello se toma un volumen de 2 5 mL de un cultivo crecido en medio liquido y se centrifuga aislando asi las celulas de aquel Despues se resuspende dicho sedimento y se expone dicha suspension a una disolucion que contiene NaOH y dodecilsulfato de sodio SDS la cual solubiliza en parte la membrana externa de las bacterias Gram negativas lo que produce la liberacion del contenido celular de estas ADN genomico y plasmidico desnaturalizados ARN proteinas Tras esto se anade a la mezcla acetato potasico acidico lo cual neutraliza todo los desechos celulares y provoca la rapida renaturalizacion del ADN plasmidico que queda en suspension mientras que el genomico y el resto de componentes celulares se reticulan y precipitan ayudados por la alta concentracion de sales especialmente del recien generado dodecil sulfato de potasio Finalmente se centrifuga nuevamente la mezcla para aislar el sobrenadante rico en el ADN plasmidico y en ARN el cual debera ser eliminado mediante una ribonucleasa El protocolo se puede mejorar con la fenolizacion fenol cloroformo isoamilico de las muestras de ADN La miniprep es la tecnica inicial de purificacion y concentracion de ADN plasmidico para cualquiera de sus posibles fines entre los que destaca la clonacion biologia Referencias EditarBirnboim HC Doly J Nucleic Acids Res 1979 Nov 24 7 6 1513 23 Enlaces externos EditarProtocolo general de lisis alcalina En ingles Datos Q455079 Obtenido de https es wikipedia org w index php title Miniprep amp oldid 138714053, wikipedia, wiki, leyendo, leer, libro, biblioteca,
