El Sistema de dos híbridos o técnica del doble híbrido en levadura es una técnica de biología molecular usada para detectar interacción entre dos proteínas. A menudo se denota por Y2H (del inglés Yeast Two Hybrid). [1]
La técnica consiste en la activación de un gen reportero o más por la acción de un factor de transcripción sobre la secuencia regulatoria "UAS" (en inglés, Upstream activating sequence) localizada upstream del promotor.
El principio de la técnica es el siguiente, el factor de transcripción es separado en dos fragmentos, uno que reconoce UAS y el otro que promueve la activación de la maquinaria de transcripción. Cada fragmento es fusionado a una de las proteínas cuya interacción se desea analizar, usando técnicas de ingeniería genética. Si las proteínas forman un complejo entre sí, los dos fragmentos del factor de transcripción se encontrarán y el gen reportero será transcrito.
Esquema de la técnica del doble híbrido.
Historia
Aplicada por primera vez por Stanley Fields y Song en 1989, esta técnica fue diseñada originalmente para detectar interacciones proteína-proteína usando el activador transcripcional GAL4 de la levadura Saccharomyces cerevisiae. La transcripción activada por GAL4 daba lugar a una proteína implicada en la utilización de galactosa, lo que constituía la base para la selección.[2] Desde entonces, el mismo principio se ha ido adaptando para dar lugar a otros métodos alternativos, incluyendo algunos capaces de detectar interacciones ADN-proteína y ADN-ADN. Asimismo, se usa también en la actualidad Escherichia coli en lugar de levadura.[3]
Principios de la técnica
La técnica del doble híbrido se basa en el hecho de que la mayoría de factores de transcripción eucarióticos tiene una organización modular; poseen un dominio de activación y otro de interacción, que pueden funcionar si se encuentran próximos el uno al otro, pero sin necesidad de estar unidos directamente.[4] Esto quiere decir que incluso aunque el factor de transcripción sea separado en dos fragmentos, es capaz de activar la transcripción cuando los dos fragmentos son conectados indirectamente.
El método de rastreo más común es el ensayo del doble híbrido en levadura.[5] Este sistema suele servirse de una cepa de levadura modificada genéticamente para que sea defectiva en la biosíntesis de ciertos nutrientes (comúnmente aminoácidos o ácidos nucleicos). Cuando estas cepas se cultivan en medio que carecen de estos nutrientes, no son capaces de sobrevivir. Esta cepa mutante puede ser capaz de incorporar ADN foráneo vehiculado por un plásmido. En el sistema del doble híbrido de levadura, dos plásmidos independientes conteniendo el cebo y el anzuelo son simultáneamente introducidos en la cepa mutante de levadura.
Los plásmidos son diseñados para producir un producto proteico en el cual el dominio de unión al ADN (en inglés, DNA-binding domain o BD) es fusionado con una de las proteínas mientras que otro plásmido es diseñado para producir un producto proteico en el que el dominio de activación (activation domain o AD, en inglés) es fusionado con la otra proteína a estudiar. La proteína fusionada con el BD se suele denominar proteína anzuelo o cebo (bait protein en inglés), y es comúnmente una proteína conocida que el investigador utiliza para identificar nuevas dianas de unión de la misma. La proteína fusionada con el AD se conoce como proteína presa (prey protein en inglés) y puede tratarse de una única proteína conocida o de una librería de proteínas conocidas o desconocidas. En este sentido, una librería consistiría en una colección de secuencias que en conjunto codifican para todas las proteínas expresadas en un organismo o tejido, o podría ser generada por síntesis aleatoria de secuencias de DNA.[3]
Si las proteínas cebo y presa interaccionan (por ejemplo, uniéndose), se hace posible la conexión indirecta entre los dominios AD y BD, haciendo que el dominio Ad se coloque en las proximidades del sitio de inicio de la transcripción y la transcripción del gen reportero se dé. Si por el contrario no interaccionan, no se da la transcripción del gen reportero. De esta manera, una interacción entre las proteínas se puede asociar a un cambio fenotípico en la célula.[1]
Referencias
↑ Young K (1998). «Yeast two-hybrid: so many interactions, (in) so little time..». Biol Reprod58 (2): 302-11.
Fields S, Song O (1989). «A novel genetic system to detect protein-protein interactions» (abstract). Nature340 (6230): 245-6. Bibcode:1989Natur.340..245F. PMID 2547163. doi:10.1038/340245a0. Abstract is free; full-text article is not.
↑ Error en la cita: Etiqueta <ref> no válida; no se ha definido el contenido de las referencias llamadas hurt
Verschure P, Visser A, Rots M (2006). . Adv Genet56: 163-204. PMID 16735158. doi:10.1016/S0065-2660(06)56005-5. Archivado desde el original el 17 de diciembre de 2008.
Gietz R.D., Triggs-Raine Barbara, Robbins Anne, Graham Kevin, Woods Robin (1997). «Identification of proteins that interact with a protein of interest: Applications of the yeast two-hybrid system». Mol Cel Biochem172 (1–2): 67-79. PMID 9278233. doi:10.1023/A:1006859319926.
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Datos:Q1337844
Febrero 26, 2023
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El Sistema de dos hibridos o tecnica del doble hibrido en levadura es una tecnica de biologia molecular usada para detectar interaccion entre dos proteinas A menudo se denota por Y2H del ingles Yeast Two Hybrid 1 La tecnica consiste en la activacion de un gen reportero o mas por la accion de un factor de transcripcion sobre la secuencia regulatoria UAS en ingles Upstream activating sequence localizada upstream del promotor El principio de la tecnica es el siguiente el factor de transcripcion es separado en dos fragmentos uno que reconoce UAS y el otro que promueve la activacion de la maquinaria de transcripcion Cada fragmento es fusionado a una de las proteinas cuya interaccion se desea analizar usando tecnicas de ingenieria genetica Si las proteinas forman un complejo entre si los dos fragmentos del factor de transcripcion se encontraran y el gen reportero sera transcrito Esquema de la tecnica del doble hibrido Historia EditarAplicada por primera vez por Stanley Fields y Song en 1989 esta tecnica fue disenada originalmente para detectar interacciones proteina proteina usando el activador transcripcional GAL4 de la levadura Saccharomyces cerevisiae La transcripcion activada por GAL4 daba lugar a una proteina implicada en la utilizacion de galactosa lo que constituia la base para la seleccion 2 Desde entonces el mismo principio se ha ido adaptando para dar lugar a otros metodos alternativos incluyendo algunos capaces de detectar interacciones ADN proteina y ADN ADN Asimismo se usa tambien en la actualidad Escherichia coli en lugar de levadura 3 Principios de la tecnica EditarLa tecnica del doble hibrido se basa en el hecho de que la mayoria de factores de transcripcion eucarioticos tiene una organizacion modular poseen un dominio de activacion y otro de interaccion que pueden funcionar si se encuentran proximos el uno al otro pero sin necesidad de estar unidos directamente 4 Esto quiere decir que incluso aunque el factor de transcripcion sea separado en dos fragmentos es capaz de activar la transcripcion cuando los dos fragmentos son conectados indirectamente El metodo de rastreo mas comun es el ensayo del doble hibrido en levadura 5 Este sistema suele servirse de una cepa de levadura modificada geneticamente para que sea defectiva en la biosintesis de ciertos nutrientes comunmente aminoacidos o acidos nucleicos Cuando estas cepas se cultivan en medio que carecen de estos nutrientes no son capaces de sobrevivir Esta cepa mutante puede ser capaz de incorporar ADN foraneo vehiculado por un plasmido En el sistema del doble hibrido de levadura dos plasmidos independientes conteniendo el cebo y el anzuelo son simultaneamente introducidos en la cepa mutante de levadura Los plasmidos son disenados para producir un producto proteico en el cual el dominio de union al ADN en ingles DNA binding domain o BD es fusionado con una de las proteinas mientras que otro plasmido es disenado para producir un producto proteico en el que el dominio de activacion activation domain o AD en ingles es fusionado con la otra proteina a estudiar La proteina fusionada con el BD se suele denominar proteina anzuelo o cebo bait protein en ingles y es comunmente una proteina conocida que el investigador utiliza para identificar nuevas dianas de union de la misma La proteina fusionada con el AD se conoce como proteina presa prey protein en ingles y puede tratarse de una unica proteina conocida o de una libreria de proteinas conocidas o desconocidas En este sentido una libreria consistiria en una coleccion de secuencias que en conjunto codifican para todas las proteinas expresadas en un organismo o tejido o podria ser generada por sintesis aleatoria de secuencias de DNA 3 Si las proteinas cebo y presa interaccionan por ejemplo uniendose se hace posible la conexion indirecta entre los dominios AD y BD haciendo que el dominio Ad se coloque en las proximidades del sitio de inicio de la transcripcion y la transcripcion del gen reportero se de Si por el contrario no interaccionan no se da la transcripcion del gen reportero De esta manera una interaccion entre las proteinas se puede asociar a un cambio fenotipico en la celula 1 Referencias Editar a b Young K 1998 Yeast two hybrid so many interactions in so little time Biol Reprod 58 2 302 11 Fields S Song O 1989 A novel genetic system to detect protein protein interactions abstract Nature 340 6230 245 6 Bibcode 1989Natur 340 245F PMID 2547163 doi 10 1038 340245a0 Abstract is free full text article is not a b Error en la cita Etiqueta lt ref gt no valida no se ha definido el contenido de las referencias llamadas hurt Verschure P Visser A Rots M 2006 Step out of the groove epigenetic gene control systems and engineered transcription factors Adv Genet 56 163 204 PMID 16735158 doi 10 1016 S0065 2660 06 56005 5 Archivado desde el original el 17 de diciembre de 2008 Gietz R D Triggs Raine Barbara Robbins Anne Graham Kevin Woods Robin 1997 Identification of proteins that interact with a protein of interest Applications of the yeast two hybrid system Mol Cel Biochem 172 1 2 67 79 PMID 9278233 doi 10 1023 A 1006859319926 En Wikiversidad existe un proyecto de aprendizaje sobre el tema en el Departamento de Biologia CLICK ACA Datos Q1337844 Obtenido de https es wikipedia org w index php title Sistema de doble hibrido amp oldid 147900728, wikipedia, wiki, leyendo, leer, libro, biblioteca,
