La secuenciación del exoma, también conocida como secuenciación del exoma completo (WES), es una técnica genómica utilizada para secuenciar todas las regiones de los genes que codifican para proteínas en un genoma (conocido como exoma). Esta técnica consta de dos pasos claramente diferenciados: el primer paso es seleccionar solamente el ADN que codifica para proteínas. Estas regiones se conocen como exones - los humanos tenemos alrededor de 180.000 exones, que constituyen casi un 1% del genoma humano, aproximadamente 30 millones de pares de bases. El segundo paso es secuenciar este ADN utilizando cualquier técnica de secuenciación de alto rendimiento.[1]
Flujo de trabajo de la secuenciación de exoma: parte 1.
Utilizando este enfoque se pretende identificar aquellas variantes genéticas que alteran las secuencias de proteínas, y hacerlo a un costo mucho menor que una secuenciación de genoma completo. Puesto que estas variantes pueden ser responsables tanto de Enfermedades Mendelianas como de Enfermedades poligénicas comunes, como puede ser el Alzheimer, la secuenciación de exoma completo se está aplicando no solamente en investigación académica, sino también diagnóstico clínico.
Flujo de trabajo de la secuenciación de exoma: parte 2
Detección de mutaciones en cáncereditar
Una de las muchas utilidades que tiene actualmente la secuenciación del exoma completo es utilizarla como base para detectar variaciones de nucleótido único o "SNV" (Single Nucleotide Variant), que de alguna manera estén relacionadas con la aparición de un tumor. Además, al ser un análisis del exoma, estas variaciones se reducen solamente a genes que codifican para proteínas, por lo que su detección aporta información de gran interés, no sólo al campo de investigación del cáncer sino también a la investigación de proteínas y de biología molecular.
El mayor problema que presentan este tipo de estudios es su baja reproducibilidad (11-49%), junto con una falta de consenso sobre cuáles son los protocolos óptimos durante las distintas etapas del procesamiento de la muestra, desde su obtención y almacenaje, hasta las distintas herramientas bioinformáticas utilizadas para analizar los datos. Tratando de solventar algunos de estos problemas, se realizó un macro estudio en el que se compararon datos de WGS y de WES de distintos tipos de muestras de la misma línea celular tumoral, de ocho centros distintos utilizando protocolos, cantidades de entrada de ADN y secuenciadores diferentes.[2] Las recomendaciones obtenidas del trabajo fueron las siguientes:
Cantidad de ADN de entrada y construcción de librería: el tamaño de fragmento ideal estaría entre 250-350 pares de bases (pb), el método de fragmentación sonicación para fragmentos de más de 250pb y enzimático para fragmentos menores de 200pb. En cuanto a la cantidad de ADN depende de la librería escogida, 200-1000ng para TruSeq PCR-free, 10-200ng para TruSeq-Nano o 1-100ng para Nextera Flex.
Cobertura de lectura y seguro de calidad: si el porcentaje de contenido en células tumorales de la muestra es mayor al 50%, se recomienda coberturas x100, pero si el contenido es menor a 50%, se recomienda una cobertura x200. Además para asegurar una buena calidad de los resultados se recomienda que las lecturas redundantes sean menores a un 30%, que las mapeables sean superiores a un 95%, que el contenido en GC esté entre 45-48% y un GIV menor a 1,5.
Programas de alineamiento: se utilizaron tres Bowtie2, BWA-MEM y NovoAlign pero no se encontraron diferencias significativas para WES.
Detector de mutaciones: de los tres utilizados (MuTect2, SomaticSniper y Strelka2) el que obtuvo mejores resultados con mucha diferencia fue MuTect2.
Además, como observaciones finales en este trabajo se concluyó que la detección de mutaciones en cancer es un proceso inherentemente integrado del cual cada componente y cada combinación de estos es igual de importante y, finalmente, que los estudios de revisión y validación deben realizarse teniendo en cuenta todo el proceso, desde la muestra hasta el resultado.
Referenciaseditar
Ng SB, Turner EH, Robertson PD, Flygare SD, Bigham AW, Lee C, Shaffer T, Wong M, Bhattacharjee A, Eichler EE, Bamshad M, Nickerson DA, Shendure J (10 de septiembre de 2009). «Targeted capture and massively parallel sequencing of 12 human exomes». Nature461 (7261): 272-276. Bibcode:2009Natur.461..272N. PMC 2844771. PMID 19684571. doi:10.1038/nature08250.
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La secuenciacion del exoma tambien conocida como secuenciacion del exoma completo WES es una tecnica genomica utilizada para secuenciar todas las regiones de los genes que codifican para proteinas en un genoma conocido como exoma Esta tecnica consta de dos pasos claramente diferenciados el primer paso es seleccionar solamente el ADN que codifica para proteinas Estas regiones se conocen como exones los humanos tenemos alrededor de 180 000 exones que constituyen casi un 1 del genoma humano aproximadamente 30 millones de pares de bases El segundo paso es secuenciar este ADN utilizando cualquier tecnica de secuenciacion de alto rendimiento 1 Flujo de trabajo de la secuenciacion de exoma parte 1 Utilizando este enfoque se pretende identificar aquellas variantes geneticas que alteran las secuencias de proteinas y hacerlo a un costo mucho menor que una secuenciacion de genoma completo Puesto que estas variantes pueden ser responsables tanto de Enfermedades Mendelianas como de Enfermedades poligenicas comunes como puede ser el Alzheimer la secuenciacion de exoma completo se esta aplicando no solamente en investigacion academica sino tambien diagnostico clinico Flujo de trabajo de la secuenciacion de exoma parte 2Deteccion de mutaciones en cancer editarUna de las muchas utilidades que tiene actualmente la secuenciacion del exoma completo es utilizarla como base para detectar variaciones de nucleotido unico o SNV Single Nucleotide Variant que de alguna manera esten relacionadas con la aparicion de un tumor Ademas al ser un analisis del exoma estas variaciones se reducen solamente a genes que codifican para proteinas por lo que su deteccion aporta informacion de gran interes no solo al campo de investigacion del cancer sino tambien a la investigacion de proteinas y de biologia molecular El mayor problema que presentan este tipo de estudios es su baja reproducibilidad 11 49 junto con una falta de consenso sobre cuales son los protocolos optimos durante las distintas etapas del procesamiento de la muestra desde su obtencion y almacenaje hasta las distintas herramientas bioinformaticas utilizadas para analizar los datos Tratando de solventar algunos de estos problemas se realizo un macro estudio en el que se compararon datos de WGS y de WES de distintos tipos de muestras de la misma linea celular tumoral de ocho centros distintos utilizando protocolos cantidades de entrada de ADN y secuenciadores diferentes 2 Las recomendaciones obtenidas del trabajo fueron las siguientes Cantidad de ADN de entrada y construccion de libreria el tamano de fragmento ideal estaria entre 250 350 pares de bases pb el metodo de fragmentacion sonicacion para fragmentos de mas de 250pb y enzimatico para fragmentos menores de 200pb En cuanto a la cantidad de ADN depende de la libreria escogida 200 1000ng para TruSeq PCR free 10 200ng para TruSeq Nano o 1 100ng para Nextera Flex Cobertura de lectura y seguro de calidad si el porcentaje de contenido en celulas tumorales de la muestra es mayor al 50 se recomienda coberturas x100 pero si el contenido es menor a 50 se recomienda una cobertura x200 Ademas para asegurar una buena calidad de los resultados se recomienda que las lecturas redundantes sean menores a un 30 que las mapeables sean superiores a un 95 que el contenido en GC este entre 45 48 y un GIV menor a 1 5 Programas de alineamiento se utilizaron tres Bowtie2 BWA MEM y NovoAlign pero no se encontraron diferencias significativas para WES Detector de mutaciones de los tres utilizados MuTect2 SomaticSniper y Strelka2 el que obtuvo mejores resultados con mucha diferencia fue MuTect2 Ademas como observaciones finales en este trabajo se concluyo que la deteccion de mutaciones en cancer es un proceso inherentemente integrado del cual cada componente y cada combinacion de estos es igual de importante y finalmente que los estudios de revision y validacion deben realizarse teniendo en cuenta todo el proceso desde la muestra hasta el resultado Referencias editar Ng SB Turner EH Robertson PD Flygare SD Bigham AW Lee C Shaffer T Wong M Bhattacharjee A Eichler EE Bamshad M Nickerson DA Shendure J 10 de septiembre de 2009 Targeted capture and massively parallel sequencing of 12 human exomes Nature 461 7261 272 276 Bibcode 2009Natur 461 272N PMC 2844771 PMID 19684571 doi 10 1038 nature08250 Zhao Yongmei Fang Li Tai Shen Tsai wei Choudhari Sulbha Talsania Keyur Chen Xiongfong Shetty Jyoti Kriga Yuliya Tran Bao Zhu Bin Chen Zhong Chen Wanqiu Wang Charles Jaeger Erich Meerzaman Daoud Lu Charles Idler Kenneth Ren Luyao Zheng Yuanting Shi Leming Petitjean Virginie Sultan Marc Hung Tiffany Peters Eric Drabek Jiri Vojta Petr Maestro Roberta Gasparotto Daniela Koks Sulev Reimann Ene Scherer Andreas Nordlund Jessica Liljedahl Ulrika Foox Jonathan Mason Christopher E Xiao Chunlin Hong Huixiao Xiao Wenming 9 de noviembre de 2021 Whole genome and exome sequencing reference datasets from a multi center and cross platform benchmark study Scientific Data 8 1 296 doi 10 1038 s41597 021 01077 5 nbsp Datos Q5420592 Obtenido de https es wikipedia org w index php title Secuenciacion del exoma amp oldid 152421276, wikipedia, wiki, leyendo, leer, libro, biblioteca,
