El Análisis en Serie de la Expresión Génica (o SAGE, Serial Analysis of Gene Expression) es una técnica de la Biología Molecular que permite conocer y cuantificar la expresión de los genes en la célula, mediante la medición de los ARNm que están presentes en esta en un momento determinado. Esto permite crear perfiles de expresión de cada célula en determinadas situaciones, ya sea en circunstancias normales de la célula o en momentos en que se ve afectada por alguna enfermedad. De esta manera se pueden comparar estos perfiles y determinar que genes están siendo apagados o activados, y así determinar cual puede ser la causa de esto.
La base de la técnica está en el uso de "tags" de ADNc que son pequeños fragmentos de ARNm que han sido transformadas a ADNc. En la técnica original, pequeñas secuencias de 8 a 14 pb son extraídas de cada ADNc (transcrito) para ser sequenciadas. En SuperSAGE, su más avanzada versión se obtienen "tags" de 26 pb, mucho más precisos y versátiles. Estos "tags" representan a un ARNm presente en la célula en un momento determinado. De esta manera se puede realizar una secuenciación de estas pequeñas hebras, diferenciando a un ARNm de otro, utilizando las bases de datos de secuencias de ARNm, y de esta manera se puede saber la cantidad de ARNm (expresión) que hay y a qué proteína codifica, identificándose su importancia. De esta manera se permite un análisis rápido de la expresión, conservándose un alto nivel de precisión.
La técnica fue desarrollada por el Dr. Victor Velculescu del Centro de Oncología de la Johns Hopkins University, y se presentó el 20 de octubre de 1995 en la revista Science. SuperSAGE, su más avanzada versión, ha sido desarrollada por Hideo Matsumura et al. en el 2003 en la revista PNAS.
Otras variantes de la técnica, como el LongSAGE o el MicroSAGE, aunque éstas sólo presentan pequeñas variaciones al SAGE tradicional en donde el tamaño del "tag" es todavía pequeño: SAGE 14 pb y LongSAGE 18 pb. SuperSAGE, con "tags" de 26 pb, permite óptima anotación, y análisis de nuevos transcriptos en conjunción con técnicas como extensión hacia los extremos (3'-y 5'-RACE).
Procedimiento
La técnica básicamente se desarrolla de la siguiente manera:
1. Se extrae todo el ARNm de una muestra, mediante cualquier método de purificación.
2. Aprovechando la característica del ARNm de tener una cola de Adeninas en el extremo 3' (poli A), se utiliza un soporte con colas de Timina para provocar la unión de los ARNm al soporte. Estas Timinas cumplen la función de Partidores o Primers para poder sintetizar ADNc a partir de los ARNm por medio de una Transcriptasa inversa. Esto tiene como ventaja la mayor estabilidad del ADNc frente al ARNm.
3. Se corta el ADNc a una distancia determinada a partir del soporte de timinas por medio de una enzima de restricción, dejando extremos cohesivos en el sitio de corte.
4. En este extremo adhesivo se une una molécula llamada "linker", la cual posee una enzima de restricción tipo II que corta nuevamente el ADNc, esta vez dejando un extremo romo. Aquí se obtiene por primera vez un "tag" de ADNc (ARNm), unido a las secuencias que han permitido las hibridaciones.
5. Se unen dos "tags" para formar un "ditag", es decir, dos tags junto a dos moléculas "linkers" distintas (linker A y linker B). Posteriormente, se procede a amplificar por PCR (Reacción en cadena de la polimerasa) para obtener una mayor cantidad de ditags y favorecer la secuenciación.
6. Los ditags se cortan con la primera enzima de restricción para eliminar los "linkers" y dejar a los ditags puros y con un extremo adhesivo, permitiendo la unión de estos en una gran hebra de ADNc (ditags) o concatenado de ADNc. Éste concatenado se pasa luego a un vector de clonamiento para obtener múltiples copias de éste.
7. Por último, se procede a secuenciar este concatenado de ditags, identificando cuántos tags hay en total de cada ARNm, y se procede a identificar qué proteína codifican, mediante el uso de alguna base de datos. Este es el paso más largo de todos, y dependiendo de la cantidad de ARNm que se esté analizando puede durar desde semanas hasta incluso meses.
Referencias
Oncology Centre at Johns Hopkins University
Velculescu VE, Zhang L, Vogelstein B, and Kinzler kW. 1995. Serial Analysis of Gene Expression. Science 270:484-7 PMID 7570003
Hideo Matsumura, Stefanie Reich, Akiko Ito, Hiromasa Saitoh, Sophien Kamoun, Peter Winter, Günter Kahl, Monika Reuter, Detlev H. Krüger, and Ryohei Terauchi (2003) Gene expression analysis of plant host–pathogen interactions by SuperSAGE, PNAS 100: 15718–15723.
A review of the SAGE technique at the Science Creative Quarterly
Datos:Q286721
Mayo 13, 2022
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El Analisis en Serie de la Expresion Genica o SAGE Serial Analysis of Gene Expression es una tecnica de la Biologia Molecular que permite conocer y cuantificar la expresion de los genes en la celula mediante la medicion de los ARNm que estan presentes en esta en un momento determinado Esto permite crear perfiles de expresion de cada celula en determinadas situaciones ya sea en circunstancias normales de la celula o en momentos en que se ve afectada por alguna enfermedad De esta manera se pueden comparar estos perfiles y determinar que genes estan siendo apagados o activados y asi determinar cual puede ser la causa de esto La base de la tecnica esta en el uso de tags de ADNc que son pequenos fragmentos de ARNm que han sido transformadas a ADNc En la tecnica original pequenas secuencias de 8 a 14 pb son extraidas de cada ADNc transcrito para ser sequenciadas En SuperSAGE su mas avanzada version se obtienen tags de 26 pb mucho mas precisos y versatiles Estos tags representan a un ARNm presente en la celula en un momento determinado De esta manera se puede realizar una secuenciacion de estas pequenas hebras diferenciando a un ARNm de otro utilizando las bases de datos de secuencias de ARNm y de esta manera se puede saber la cantidad de ARNm expresion que hay y a que proteina codifica identificandose su importancia De esta manera se permite un analisis rapido de la expresion conservandose un alto nivel de precision La tecnica fue desarrollada por el Dr Victor Velculescu del Centro de Oncologia de la Johns Hopkins University y se presento el 20 de octubre de 1995 en la revista Science SuperSAGE su mas avanzada version ha sido desarrollada por Hideo Matsumura et al en el 2003 en la revista PNAS Otras variantes de la tecnica como el LongSAGE o el MicroSAGE aunque estas solo presentan pequenas variaciones al SAGE tradicional en donde el tamano del tag es todavia pequeno SAGE 14 pb y LongSAGE 18 pb SuperSAGE con tags de 26 pb permite optima anotacion y analisis de nuevos transcriptos en conjuncion con tecnicas como extension hacia los extremos 3 y 5 RACE Procedimiento EditarLa tecnica basicamente se desarrolla de la siguiente manera 1 Se extrae todo el ARNm de una muestra mediante cualquier metodo de purificacion 2 Aprovechando la caracteristica del ARNm de tener una cola de Adeninas en el extremo 3 poli A se utiliza un soporte con colas de Timina para provocar la union de los ARNm al soporte Estas Timinas cumplen la funcion de Partidores o Primers para poder sintetizar ADNc a partir de los ARNm por medio de una Transcriptasa inversa Esto tiene como ventaja la mayor estabilidad del ADNc frente al ARNm 3 Se corta el ADNc a una distancia determinada a partir del soporte de timinas por medio de una enzima de restriccion dejando extremos cohesivos en el sitio de corte 4 En este extremo adhesivo se une una molecula llamada linker la cual posee una enzima de restriccion tipo II que corta nuevamente el ADNc esta vez dejando un extremo romo Aqui se obtiene por primera vez un tag de ADNc ARNm unido a las secuencias que han permitido las hibridaciones 5 Se unen dos tags para formar un ditag es decir dos tags junto a dos moleculas linkers distintas linker A y linker B Posteriormente se procede a amplificar por PCR Reaccion en cadena de la polimerasa para obtener una mayor cantidad de ditags y favorecer la secuenciacion 6 Los ditags se cortan con la primera enzima de restriccion para eliminar los linkers y dejar a los ditags puros y con un extremo adhesivo permitiendo la union de estos en una gran hebra de ADNc ditags o concatenado de ADNc Este concatenado se pasa luego a un vector de clonamiento para obtener multiples copias de este 7 Por ultimo se procede a secuenciar este concatenado de ditags identificando cuantos tags hay en total de cada ARNm y se procede a identificar que proteina codifican mediante el uso de alguna base de datos Este es el paso mas largo de todos y dependiendo de la cantidad de ARNm que se este analizando puede durar desde semanas hasta incluso meses Referencias EditarOncology Centre at Johns Hopkins University Velculescu VE Zhang L Vogelstein B and Kinzler kW 1995 Serial Analysis of Gene Expression Science 270 484 7 PMID 7570003 Hideo Matsumura Stefanie Reich Akiko Ito Hiromasa Saitoh Sophien Kamoun Peter Winter Gunter Kahl Monika Reuter Detlev H Kruger and Ryohei Terauchi 2003 Gene expression analysis of plant host pathogen interactions by SuperSAGE PNAS 100 15718 15723 1 Enlaces externos EditarSAGEnet SAGE for Beginners A review of the SAGE technique at the Science Creative Quarterly Datos Q286721 Obtenido de https es wikipedia org w index php title Analisis en serie de la expresion genica amp oldid 120657341, wikipedia, wiki, leyendo, leer, libro, biblioteca,
